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铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助镍柱亲和层析高手指点

在大肠杆菌中高表达一个6HIS标签融合蛋白，为包涵体形式，溶于6M尿素缓冲液（pH8.0，含咪唑5mM）后，进行镍柱亲和层析，发现从一开始上样，其上样流出液中即有很少的标签蛋白渗漏现象，请问这样正常吗？标签蛋白的挂柱率可以达到100%吗？图中泳道2中最浓的那条为标签蛋白，泳道3-9均为上样时流出液

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1楼 2015-10-11 13:56:22

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银虫 (小有名气)

没问题，一般重组蛋白时组氨酸X6标签的蛋白质对镍柱亲和力大。额，楼主用咪唑5mM就能洗脱下来一点点，建议用10mM咪唑试试，看看能不能洗脱下来，如果洗的下来有可能蛋白质形成了多聚体、或者与DNA相互作用遮蔽了（His）6位点，使之不能结合。我们一般要到20mM甚至更多才能洗的下来。

我好累，承受这个年纪不该有的帅！

3楼2015-10-27 10:50:04

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银虫 (初入文坛)

正常啊，挂柱率不可能100％的，更何况这个还是包涵体复性的

2楼2015-10-15 10:50:56

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