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lovenier2006

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助镍柱亲和层析高手指点

在大肠杆菌中高表达一个6HIS标签融合蛋白,为包涵体形式,溶于6M尿素缓冲液(pH8.0,含咪唑5mM)后,进行镍柱亲和层析,发现从一开始上样,其上样流出液中即有很少的标签蛋白渗漏现象,请问这样正常吗?标签蛋白的挂柱率可以达到100%吗?图中泳道2中最浓的那条为标签蛋白,泳道3-9均为上样时流出液

求助镍柱亲和层析高手指点
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skyline0309

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

正常啊,挂柱率不可能100%的,更何况这个还是包涵体复性的
2楼2015-10-15 10:50:56
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

没问题,一般重组蛋白时组氨酸X6标签的蛋白质对镍柱亲和力大。额, 楼主用咪唑5mM就能洗脱下来一点点,建议用10mM咪唑试试,看看能不能洗脱下来,如果洗的下来有可能蛋白质形成了多聚体、或者与DNA相互作用遮蔽了(His)6位点,使之不能结合。我们一般要到20mM甚至更多才能洗的下来。
我好累,承受这个年纪不该有的帅!
3楼2015-10-27 10:50:04
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