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xtmgah31

银虫 (小有名气)

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[交流] 棉花基因组DNA提取

有谁提过棉花的基因组DNA啊，我提出来怎么会有三个条带呢？它完整的基因组DNA大小大概多少呢？

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-12 at 09:12 ]

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1楼 2008-09-03 17:45:58

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shenye.judy

木虫 (正式写手)

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专业: 植物遗传学

★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0): 7-12 16:10

1.材料的采集
采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存.
2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程
各加入液体的配制：
1、CTAB提取液：
2%（W/V g/mol ）CTAB；
5%（W/V g/mol）PVP；
1.4mol/lNaCl；
20mmol/L EDTA PH=8.0；
l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0；
2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)
配制量：500ml
配制方法：
(1)计算所需组分量
CTAB             10g 需热磁力搅拌
PVP             25g
NaCl             40.908g
EDTA.Na2.2H2O       3.7224g 调PH=8 冷却为常温时(母液)
Tris             6.057g
(2)称取CTAB 10 g， NaCl 40.908g， PVP 25g置于500ml烧杯中
(3)加入约300dd H2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解
(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)
(4)量取20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 )， 50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合
(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌
(6)室温保存。
0.5mol/LEDTA 配制
组分浓度： 0.5mol/l EDTA， PH=8
配制量：500ml
配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中
(2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌
(3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH
(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8
(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml
(6)高温高压灭菌后，室温保存
NaOH溶液的配制
组分浓度：5 mol/l NaOH
配制量：100 ml
配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中
(2)加入dd H2O定容到100 ml
100 mmol/l Tris-HCl的配制
组分浓度： mmol/l Tris-HCl， PH=6.4
配制量：250 ml
配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中.
  (2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解.
  (3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml
  (4)将溶液定容至250ml
  (5)用棕色瓶分装于4度冰箱中
  (6)如使用，用水浴加热溶解.
2、氯仿-异戊醇的配制：
配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可
(2)储存于棕色玻璃瓶子中
(3)置于4度冰箱以便日后使用
3总的实验流程
3.1．总的DNA的提取：
1. 在10ml离心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热
2. 取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀.
3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4℃下离心12000rpm 10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20℃冰箱中备用.
各加入液的用途：
（1）去污剂：
CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.
EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.
（2）还原剂
巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.
（3）氯仿—异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳
水化合物等分开除去.
（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.
3.2．总DNA的纯化
操作步骤：
1. 取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物.
2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm 15s 弃掉上清液.（打碎很重要，多打一会）
3. 重复上一步一次.
4. 用70%的1ml乙醇将硅珠——核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s，弃上清液，打散，最后用1ml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm 15s，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟.
5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56度水浴中保温10分钟，然后离心12000rpm 5min.取上清液即为所需的DNA.
6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋），加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋，并于56度水浴中保温10min， 12000rpm 5min，取上清液于步骤5管中共存.
7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm 10min ，取上清液存于-20℃冰箱中.
仪器的使用
真空干燥器：
  在使用前要求先预热30分钟，只打开1号阀门.
  打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启2号——3号——4号——5号门.进行干燥处理5分钟.
  关闭各阀门.顺序为5号——4号——3号——2号——1号阀门.
各加入液的配制
1、硅珠悬浮液的配制
（1）称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中.
（2）放入4℃冰箱备用.
（3）使用时先涡旋使其混合均匀.
2、漂洗液的配制
称取GuSCN（可能产生有毒气体，要求在通风橱中进行）120克溶解于100mlTris-HCl(100mM PH6.4)中.要求在60℃水浴中溶解.