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xtmgah31银虫 (小有名气)
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[交流]
棉花基因组DNA提取
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有谁提过棉花的基因组DNA啊，我提出来怎么会有三个条带呢？它完整的基因组DNA大小大概多少呢？ [ Last edited by 350784478 on 2009-7-12 at 09:12 ] |
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xtmgah31
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3楼2008-09-04 14:59:57
shenye.judy
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司马诸葛(金币+2,VIP+0): 7-12 16:10
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1.材料的采集 采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存. 2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程 各加入液体的配制： 1、CTAB提取液： 2%（W/V g/mol ）CTAB； 5%（W/V g/mol）PVP； 1.4mol/lNaCl； 20mmol/L EDTA PH=8.0； l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0； 2%(V/V)巯基乙醇(临时加入) 配制量：500ml 配制方法： (1)计算所需组分量 CTAB 10g 需热磁力搅拌 PVP 25g NaCl 40.908g EDTA.Na2.2H2O 3.7224g 调PH=8 冷却为常温时(母液) Tris 6.057g (2)称取CTAB 10 g， NaCl 40.908g， PVP 25g置于500ml烧杯中 (3)加入约300dd H2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解 (注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止) (4)量取20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 )， 50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合 (5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌 (6)室温保存。 0.5mol/LEDTA 配制 组分浓度： 0.5mol/l EDTA， PH=8 配制量：500ml 配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中 (2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 (3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH (4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8 (5)加dd H2O将溶液定容到500 ml (6)高温高压灭菌后，室温保存 NaOH溶液的配制 组分浓度：5 mol/l NaOH 配制量：100 ml 配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中 (2)加入dd H2O定容到100 ml 100 mmol/l Tris-HCl的配制 组分浓度： mmol/l Tris-HCl， PH=6.4 配制量：250 ml 配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中. (2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解. (3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml (4)将溶液定容至250ml (5)用棕色瓶分装于4度冰箱中 (6)如使用，用水浴加热溶解. 2、氯仿-异戊醇的配制： 配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可 (2)储存于棕色玻璃瓶子中 (3)置于4度冰箱以便日后使用 3总的实验流程 3.1．总的DNA的提取： 1. 在10ml离心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热 2. 取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀. 3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4℃下离心12000rpm 10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20℃冰箱中备用. 各加入液的用途： （1）去污剂： CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性. EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA. （2）还原剂 巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐. （3）氯仿—异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳 水化合物等分开除去. （4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA. 3.2．总DNA的纯化 操作步骤： 1. 取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物. 2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm 15s 弃掉上清液.（打碎很重要，多打一会） 3. 重复上一步一次. 4. 用70%的1ml乙醇将硅珠——核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s，弃上清液，打散，最后用1ml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm 15s，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟. 5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56度水浴中保温10分钟，然后离心12000rpm 5min.取上清液即为所需的DNA. 6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋），加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋，并于56度水浴中保温10min， 12000rpm 5min，取上清液于步骤5管中共存. 7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm 10min ，取上清液存于-20℃冰箱中. 仪器的使用 真空干燥器： 在使用前要求先预热30分钟，只打开1号阀门. 打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启2号——3号——4号——5号门.进行干燥处理5分钟. 关闭各阀门.顺序为5号——4号——3号——2号——1号阀门. 各加入液的配制 1、硅珠悬浮液的配制 （1） 称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中. （2） 放入4℃冰箱备用. （3） 使用时先涡旋使其混合均匀. 2、漂洗液的配制 称取GuSCN（可能产生有毒气体，要求在通风橱中进行）120克溶解于100mlTris-HCl(100mM PH6.4)中.要求在60℃水浴中溶解. |
4楼2008-09-04 19:07:12
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