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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Red敲除，如何消除或降低假阳性
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日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by stogqy at 2018-09-07 16:17:15
哎呀，之前放暑假回家了，没看到不好意思。我现在遇到的情况就是同源臂能单交换整合上去，但是质粒骨架掉不能通过二次交换掉下来~~...

相当于你是做两次单筛选，第一次抗性平板验证单交换，第二次用致死物质进行反筛选，这样第二个平板上能长的菌要不就是敲除株，要不就是回复突变株，理论上来说，这两者比例应该是1：1。建议加大样本量，得到更多第二次平板上筛选的菌，拿去做PCR检测。
当然，如果你敲除的是生长关键基因，可能即使在全营养平板上，敲除株本生就不能生长，那就没有筛选一说了。
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周老湿
11楼2018-09-08 09:05:42
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stogqy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 日光海 at 2018-09-08 09:05:42
相当于你是做两次单筛选，第一次抗性平板验证单交换，第二次用致死物质进行反筛选，这样第二个平板上能长的菌要不就是敲除株，要不就是回复突变株，理论上来说，这两者比例应该是1：1。建议加大样本量，得到更多第 ...

理论上是这样的啊，可实践起来真坑！不过不知道哪里飘来的运气，昨天好像拿到了一个二次重组菌，初步验证了，准备明天做测序看看。
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12楼2018-09-08 14:20:39
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日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by stogqy at 2018-09-08 14:20:39
理论上是这样的啊，可实践起来真坑！不过不知道哪里飘来的运气，昨天好像拿到了一个二次重组菌，初步验证了，准备明天做测序看看。...

毕竟敲除株相比起来比原始菌株少了一个原件，生长状态肯定难以保证。所以最终的比例肯定不会是理论上的1:1，所以只能大样本量筛选，前期提高敲除质粒的量，加大转化比率，后期大样本筛选，总能得到敲除株的。传统方法行不通的话可以考虑送公司做敲除，也就大几千到一两万，有的还可以提供CRISPR敲除，可以考虑做一下。看你时间和实验室经费
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周老湿
13楼2018-09-10 11:16:06
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