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日光海

铜虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by stogqy at 2018-09-07 16:17:15
哎呀,之前放暑假回家了,没看到不好意思。我现在遇到的情况就是同源臂能单交换整合上去,但是质粒骨架掉不能通过二次交换掉下来~~...

相当于你是做两次单筛选,第一次抗性平板验证单交换,第二次用致死物质进行反筛选,这样第二个平板上能长的菌要不就是敲除株,要不就是回复突变株,理论上来说,这两者比例应该是1:1。建议加大样本量,得到更多第二次平板上筛选的菌,拿去做PCR检测。
当然,如果你敲除的是生长关键基因,可能即使在全营养平板上,敲除株本生就不能生长,那就没有筛选一说了。
周老湿
11楼2018-09-08 09:05:42
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stogqy

铜虫 (小有名气)

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11楼: Originally posted by 日光海 at 2018-09-08 09:05:42
相当于你是做两次单筛选,第一次抗性平板验证单交换,第二次用致死物质进行反筛选,这样第二个平板上能长的菌要不就是敲除株,要不就是回复突变株,理论上来说,这两者比例应该是1:1。建议加大样本量,得到更多第 ...

理论上是这样的啊,可实践起来真坑!不过不知道哪里飘来的运气,昨天好像拿到了一个二次重组菌,初步验证了,准备明天做测序看看。
12楼2018-09-08 14:20:39
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日光海

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by stogqy at 2018-09-08 14:20:39
理论上是这样的啊,可实践起来真坑!不过不知道哪里飘来的运气,昨天好像拿到了一个二次重组菌,初步验证了,准备明天做测序看看。...

毕竟敲除株相比起来比原始菌株少了一个原件,生长状态肯定难以保证。所以最终的比例肯定不会是理论上的1:1,所以只能大样本量筛选,前期提高敲除质粒的量,加大转化比率,后期大样本筛选,总能得到敲除株的。传统方法行不通的话可以考虑送公司做敲除,也就大几千到一两万,有的还可以提供CRISPR敲除,可以考虑做一下。看你时间和实验室经费
周老湿
13楼2018-09-10 11:16:06
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