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kangaroo0513新虫 (正式写手)
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[求助]
哪位帅哥有“WB600枯草菌”和“PAX01质粒”的详细操作说明书？ 已有1人参与
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或者使用手册？？悄悄赐一个给我呗。。 以前没做过枯草，真心求详细protocol。。。 顺便请教，pAX01的MCS是不是用BamHI？然后，插入的方向是正向还是反向？网上给出的Pxyl promoter是反向的，但是把序列拷到snapgege里，发现那有个正向的Amp promoter。。于是就凌乱了。。。另外，如果是BamHI单酶切的话，需不需要加额外的SD序列和分泌信号肽？还是pAX01自身就带了分泌信号肽和SD序列了？  1111.png  1112.png |
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4楼2018-01-20 10:29:22
dorecnu
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
kangaroo0513: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-09-28 14:53:48
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kangaroo0513: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-09-28 14:53:48
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1. 从第一张图上看该质粒的MCS是not1,sacI,sacI,bamHI 2. 插入方向可以通过设计双酶切位点确定，改变待插入基因启动子和终止子的酶切位点即可确定克隆片段的插入方向。如果使用单酶切位点本身不能确定片段插入方向，但可以在后续的筛选中，通过测序筛选自己理想的片段插入方向，只是这样成本略高，不建议使用。如果只有bamhI可用，记得在单酶切链接的时候，使用碱性磷酸酶将载体去磷酸化防止载体自连接。 3. 从楼主问问的的方式来看，楼主应该是有pax01质粒的序列的，所以是否需要加入SD序列和信号肽，可以拿起始密码子上游10个碱基分析一下是否富含嘌呤即可，信号肽也的分析也是一样，都有载体序列了这些不是一看就知道吗？ 4. 至于启动子方向那就更简单了，不管软件的分析结果，拿载体序列，分析起始密码子上游和下游系列，看是否都存在启动子典型的-35区“AATGTGTGGAAT”和-10区“TTGACATATATT”相近的序列及AGGAGG核糖体结合位点（新手可以使用http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm帮助一下预测），如果双向都有，建议用PxyA作为启动子。 5. 据我的经验该质粒应该不自带外分泌信号肽，这个很好解决，在设计插入基因时，自己加入一段就可以了。 祝实验顺利！ |
2楼2015-09-28 09:51:32
kangaroo0513
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感谢。。。我上传个gb格式的序列文件，您帮我瞧一下具体有莫有信号肽和RBS？我的初步判断也是没有，但是由于第一次折腾枯草，不敢大意。。另外，如果我要用枯草表达一个人源的蛋白酶前体（本身带信号肽，用于定位酸性囊泡），我可以在N端再加一个分泌的信号肽让枯草把这个蛋白酶前体分泌出去不？如果可以的话，依您的经验是哪个信号肽效果会好一些？ |
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2015-09-28 12:24:12, 12.4 K
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3楼2015-09-28 12:27:01
kangaroo0513
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5楼2018-01-22 08:42:15
200