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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR
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wxb2061

银虫 (小有名气)

[求助] PCR 已有3人参与

pcr仪各阶段温度，时间设计，最近刚开始做PCR不是了解，我的基因片段1511bp，求告知
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走在途中……
1楼 2015-09-25 11:02:56
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wxb2061: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-09-25 23:38:05
预变性，94°，5min；
变性，94°，1min；
退火，根据你的引物设定温度，1min；
延伸，72°，时间根据酶的扩增速度设定（如1000 bp/min，则1.5min）；
30个循环；
72°，10min；
4°保存。

其实没那么严格，时间也可以变化的
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2楼2015-09-25 11:08:29
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cwdy

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pcr试剂说明书都会有的，退火温度一般要根据自己的引物来调，延伸时间根据产物大小来调。。
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3楼2015-09-25 17:01:48
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wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-09-25 11:08:29
预变性，94°，5min；
变性，94°，1min；
退火，根据你的引物设定温度，1min；
延伸，72°，时间根据酶的扩增速度设定（如1000 bp/min，则1.5min）；
30个循环；
72°，10min；
4°保存。

其实没那么严格 ...

根据实验室常规做法，Tm55，目的片段很淡，几乎看不到，非特异性片段很亮，试了试提高温度，最后还是没有P出来，，不知什么原因，同时做了个1841的到是有结果，难道是引物问题？设计时进行检测没看出什么问题啊。求告知，谢谢

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走在途中……
4楼2015-09-25 23:42:40
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2015-09-26 00:10:44
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wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-09-26 00:10:44
可以在Tm两侧做几个梯度
...

听过要做梯度，可否详细介绍下，这个梯度和我不同温度筛选有什么不同
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走在途中……
6楼2015-09-26 09:11:21
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2015-09-26 11:29:17
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匿名

用户注销 (小有名气)
★
wxb2061: 金币+1 2015-10-03 12:00:50
本帖仅楼主可见
赞一下
8楼2015-09-29 11:12:17
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

MarchZR

银虫 (小有名气)
这种问题酶的说明书一般都会有，不过还是有一篇资料，一般PCR的标准操作流程（http://www.detaibio.com/topics/pcr-sop.html）
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9楼2015-09-29 15:34:27
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