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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助(关于测序)
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cuicuixxl

[交流] 求助(关于测序)

请教高手:我做的是细菌16sRDNA的鉴定,由于样比较多,没有做克隆,直接送的是PCR产物到上海英俊去测,但老是说我的信号不好,或是信号弱,请高手帮忙分析一下嘛,我都重复做了三次了,我的师兄用同样的方法都测出来了的
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1楼 2008-09-01 00:20:36
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cuicuixxl

金币不多,吐血求助
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2楼2008-09-01 00:21:26
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yat

金虫 (小有名气)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
不知道你的电泳检测结果中条带是否很亮，是否有拖尾现象。
我觉得可能是你的酶保真性、稳定性不好，建议换一种酶试试。有时候同一种酶不同批次质量也不一样。
不知道你的退火温度是多少。另外退火温度再适当调一下。在理论值内，温度高一些，特异性也会强一些。
Good luck
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做最好的自己，永不放弃！
3楼2008-09-01 06:31:18
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
有两个可能，一个是你的pcr产物不纯，一个是测序公司出了问题，所以要么你重新pcr，或者先装下T载体，要么换公司测序
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4楼2008-09-01 11:45:23
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sagi_qh

金虫 (小有名气)
★
xyklmu(金币+1,VIP+0):感谢答复
检查下你的产物量怎么样，另外产物一定要纯化
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5楼2008-09-01 12:24:49
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张力民

铜虫 (小有名气)
★
xyklmu(金币+1,VIP+0):感谢答复
你应该将少量的产物跑电泳看一下亮度,如很亮且特异的话,说明不是你的问题.
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6楼2008-09-01 14:14:43
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cuicuixxl

谢谢各位,我的反应程序为
94度 5min
94度变性40s
54度退火40s
72度延伸1min
72度延伸7min
30个循环.
我每次都跑了电泳的,条带还可以,但三次都测不出来?
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7楼2008-09-01 14:52:54
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cuicuixxl

我想是不是DNA不纯啊?我的DNA没有检测的
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8楼2008-09-01 14:53:50
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
★
xyklmu(金币+1,VIP+0):感谢答复
建议你将PCR产物进行纯化，产物里的盐离子浓度过高对测序有很大影响
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9楼2008-09-01 17:25:06
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