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lwmhxy木虫 (初入文坛)
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1700bp目的片段连不上pCAMBIA2301表达载体
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| RT，我的目的片段大概1700bp，2301载体11000bp左右，可选的酶切位点为BamH I和 KpnI，双酶切，连接之后转化DH5α，过夜之后平板没长菌，已经做了2次，双酶切我是先30℃切2小时，再37℃切2小时，目的片段从T载体上切开了，载体是否双酶切开，我不确定，第三次我又重新做了一次，我先30度酶切，回收纯化之后再37度切，还是没连接上，板子还是没长菌。这2个酶切位点离得太近，是否没有双酶切开，导致目的片段没连上，培养基和抗生素Kan+都没问题。请问大家怎么办？？？连接体系目的13μl，2301载体3μl，T4buffer 2μl，T4连接酶1μl，ddH2O 1μl，16度10个小时，回收之后我也检测了，条带还可以，请问是为什么？？是不是BamH I和 KpnI这两个酶的酶切位点太相似，一个是GGATCC ，一个是GGTACC的原因？？？？？ |
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