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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lwmhxy

木虫 (初入文坛)

[交流] 1700bp目的片段连不上pCAMBIA2301表达载体

RT,我的目的片段大概1700bp,2301载体11000bp左右,可选的酶切位点为BamH I和 KpnI,双酶切,连接之后转化DH5α,过夜之后平板没长菌,已经做了2次,双酶切我是先30℃切2小时,再37℃切2小时,目的片段从T载体上切开了,载体是否双酶切开,我不确定,第三次我又重新做了一次,我先30度酶切,回收纯化之后再37度切,还是没连接上,板子还是没长菌。这2个酶切位点离得太近,是否没有双酶切开,导致目的片段没连上,培养基和抗生素Kan+都没问题。请问大家怎么办???连接体系目的13μl,2301载体3μl,T4buffer 2μl,T4连接酶1μl,ddH2O 1μl,16度10个小时,回收之后我也检测了,条带还可以,请问是为什么??是不是BamH I和 KpnI这两个酶的酶切位点太相似,一个是GGATCC ,一个是GGTACC的原因?????
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遇一人白首,择一城终老
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lwmhxy

木虫 (初入文坛)

求指导答疑
遇一人白首,择一城终老
2楼2015-09-22 10:32:38
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Neo2000

木虫 (著名写手)


lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
你想多了,问题应该还是出在酶切上

发自小木虫Android客户端
3楼2015-09-22 10:47:46
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lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
4楼2015-09-22 10:57:14
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lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
5楼2015-09-22 11:09:29
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lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
6楼2015-09-22 11:12:03
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lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
7楼2015-09-22 11:21:03
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xiaochong8693

木虫之王 (文坛精英)


lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
为楼主留下满满的、真诚的祝福
祝福楼主和各位虫友事事如意,梦想成真
祝福与祈祷中...
8楼2015-09-22 11:31:13
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lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
9楼2015-09-22 11:35:51
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lwmhxy(金币+1): 谢谢参与
10楼2015-09-22 11:36:10
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