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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 夹心ELISA法，空白显示，求助！！
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liyaid

金虫 (小有名气)

[求助] 夹心ELISA法，空白显示，求助！！ 已有8人参与

最近一直在尝试建立夹心ELISA法，但是预实验就很悲催~单抗用的是自制的小鼠腹水，多抗为自制的兔抗血清，都为纯化。用鼠单抗抗包被，兔单抗检测，结果加抗原和不加抗原都显色，而且数值几乎没有差异，但加抗原会高一点点。而包被兔多抗，鼠单抗检测，结果都不显示。重复了好多次，一开始以为是封闭问题，但换了BSA、酪蛋白和羊血清都显色啊！真不知道为什么，都要疯了？是因为没有纯化吗？单抗和多抗纯度不够？请大神指导一下！！
具体的实验步骤如下：
(1)包被：用包被缓冲液将鼠单抗腹水按1:100、 1:200和1:1000稀释。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(2)封闭：封闭液（3%的酪蛋白）每孔0.2ml，37℃，2h后洗涤。
(3)加样：加一定浓度稀释（PBST稀释）的标准品溶液(同时做空白对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37℃， 1.5h 。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(4)加检测抗体：于各反应孔中，加入稀释的兔多抗（PBST按1:200稀释）0.1ml。37℃，1.5 h，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min
(5)加抗兔IgG-HRP二抗，1:4000稀释，每孔0.1ml，37℃，1 h，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min
(6)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.05 mL，37 ℃，5 - 15min。（TMB买的）
(7)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
(7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm读数。
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加油
1楼 2015-09-21 17:32:40
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1007287532

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liyaid: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢！今天正好做了包被和不包被，发现不包被基本不显色，而包被单抗显色比较明显，所以这里是鼠抗问题比较大吗?主要问题可能是什么呢？这个鼠抗是不是就不能用了？ 2015-09-22 21:59:38
不包被抗体，直接封闭的板子跟包被抗体，封闭过的板子对照，如果不包被也显色，是你兔抗的问题多一点，如果不显色，是你鼠抗的问题多一点，而且包被的时候都要纯化的吧，不然那么多杂蛋白，难免会有非特异性结合
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2楼2015-09-22 12:23:11
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ayiyaya

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liyaid: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢，我也在考虑，这个纯度确实是个问题！ 2015-09-22 21:57:15
以前用过买的多抗做双抗夹心，也是阴性有明显的显色，你都不纯化，肯定更难控制这个问题，有条件的话还是做个纯化吧···其实个人认为，可能不是封闭的问题，毕竟血清里面的东西太多太杂，建议你先按楼上虫友的方法做个鉴定。
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3楼2015-09-22 13:58:37
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vivd娟

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不纯化的话应该结果都无法控制，需要做纯化
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4楼2015-09-23 10:41:30
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djbitter

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
双抗夹心对抗体要求高，两个抗体的纯度、特异性、亲和力;另外，酶标二抗也很重要，选择无交叉反应的，否则二抗与包被抗体就会有结合。
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5楼2015-09-24 15:25:50
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1007287532

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1007287532 at 2015-09-22 12:23:11
不包被抗体，直接封闭的板子跟包被抗体，封闭过的板子对照，如果不包被也显色，是你兔抗的问题多一点，如果不显色，是你鼠抗的问题多一点，而且包被的时候都要纯化的吧，不然那么多杂蛋白，难免会有非特异性结合

很有可能是鼠抗的问题，鼠抗杂蛋白太多，有没有抗原都跟兔抗反应，明显是非特异性反应，还有血清里产抗体好多都是多抗吧，如果是多抗可以试一下包被与标记用同一种抗体，不一定要用鼠抗的，
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6楼2015-10-23 13:46:29
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feiyue122

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

应该是你的包被的鼠单抗出问题了，如果不纯化的话，抗体有很多杂质的，很容易造成非特异性结合的
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7楼2015-10-26 14:11:48
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宇文诗畅

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

包被用的鼠抗杂质太多了，不纯化肯定会出现很多非特异性的结合的，当然加不加抗原都会显色了，纯化过的兔抗血清应该是没问题的···
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做好自己的事！
8楼2015-10-27 09:01:08
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香锅奥利奥

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主问题解决了吗，我现在也在做双抗体夹心，也出现了不加抗原就显色的原因，想询问一下您的最终解决办法，我只有这一次回复权限，求解答
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愿每天活在热爱里
9楼2020-10-28 20:35:08
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2020-10-29 01:05:30
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