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liyaid

金虫 (小有名气)

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[求助] 夹心ELISA法，空白显示，求助！！已有8人参与

最近一直在尝试建立夹心ELISA法，但是预实验就很悲催~单抗用的是自制的小鼠腹水，多抗为自制的兔抗血清，都为纯化。用鼠单抗抗包被，兔单抗检测，结果加抗原和不加抗原都显色，而且数值几乎没有差异，但加抗原会高一点点。而包被兔多抗，鼠单抗检测，结果都不显示。重复了好多次，一开始以为是封闭问题，但换了BSA、酪蛋白和羊血清都显色啊！真不知道为什么，都要疯了？是因为没有纯化吗？单抗和多抗纯度不够？请大神指导一下！！
具体的实验步骤如下：
(1)包被：用包被缓冲液将鼠单抗腹水按1:100、 1:200和1:1000稀释。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(2)封闭：封闭液（3%的酪蛋白）每孔0.2ml，37℃，2h后洗涤。
(3)加样：加一定浓度稀释（PBST稀释）的标准品溶液(同时做空白对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37℃， 1.5h 。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(4)加检测抗体：于各反应孔中，加入稀释的兔多抗（PBST按1:200稀释）0.1ml。37℃，1.5 h，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min
(5)加抗兔IgG-HRP二抗，1:4000稀释，每孔0.1ml，37℃，1 h，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min
(6)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.05 mL，37 ℃，5 - 15min。（TMB买的）
(7)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
(7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm读数。

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