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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » t4连接时间过长 有影响嘛？导致转化失败了
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hoodlum

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] t4连接时间过长 有影响嘛？导致转化失败了 已有1人参与

在转化，使用pqe和pet28a做载体，目的片段1000bp，主要是pqe的问题，用neb双酶切，酶切后纯化质粒浓度 6.7ng/ul，目的片段33ng/ul，按照1:5连接，16摄氏度连接15小时，之后有事情导致人不在，25度连接了4h左右，觉得t4连接时间长点也不怕，也没听说会激活外切酶，所以长时间t4连接应该蛮安全，但是转化没长菌… 操作没什么问题 之前都是这样做的。酶切和连接不知道哪个环节有问题，酶切的话 neb蛮靠谱的。应该是都切开了，不然板上会长克隆出来的。还有我会习惯转化是按12:50加重组液和感受态。向大神求助啊！
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1楼 2015-09-21 16:52:42
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hoodlum

捐助贵宾 (初入文坛)
我是楼主，还有同时期做的pet28a，也长出来，不过非常密集，应该是我质粒加了的缘故，所以这样看来重连应该没什么问题的，好困惑
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2楼2015-09-21 16:54:32
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hoodlum

捐助贵宾 (初入文坛)
参考一了一下其他帖子，发现还有点东西要补充，酶切位点是bamh1和hindiii 两个酶一块反应的，大概时间是1h，但是时间长了出线星标活性
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3楼2015-09-21 17:04:34
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naringenin

新虫 (小有名气)
按照1:5连接，这个是质量比么？哪个比哪个？
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4楼2015-09-21 17:31:45
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hoodlum

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by naringenin at 2015-09-21 17:31:45
按照1:5连接，这个是质量比么？哪个比哪个？

质粒比目的片段 是摩尔比 ，质粒5000bp 浓度6.7 目的片段1000bp 33 所以体积比大概是 质粒比目片 4:1  还有想多问一下多片段插入会怎么样呀？
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5楼2015-09-21 18:09:47
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naringenin

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
多片段插入效率会降低。没看出什么问题。这种一个菌都不长的话，我会首先看抗性错没错，没错的话，再看感受态效率，都没问题就认命重做了。连接酶连接时间长短，个人认为没有任何影响。
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6楼2015-09-21 19:15:25
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