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learningying铁杆木虫 (著名写手)
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Weatern Blotting实验用ECL显色请求指导
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Weatern Blotting实验用ECL显色请求指导，背景一直很深，有时候整个膜都没有办法拍照，我们用的是ECL染色，然后选择感光照片进行显影，但是结果如下，请指正。具体的实验过程如下： Sample Text 蛋白样品制备 ：按照常规的方法进行，蛋白可溶。 蛋白浓度测定：BCA蛋白浓度测定试剂盒 上样量30ug，大约体积是3ul。 (3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 先使用80 V恒压电泳约40min，观察到溴酚蓝进入分离胶界面的时候使用120V恒压电泳80min后，当溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。 （4）转膜. 恒压15V转移30min，可以看到Marker 条带清晰，分散开来。 （5）封闭 转膜结束，PBST中，漂洗3次，每次5 min，以便洗去膜上的转膜液。 吸尽转膜液，加入Western封闭液(购自碧云天)，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭60min或4℃封闭过夜。 （6）免疫染色 稀释一抗 1:1000 ；二抗 1:5000;加入PBST，加入PBST洗膜3次，每次15min。 （7）ECL发光显色 1.在暗室里将ECL试剂盒中的A液和B液等体积充分混匀。 2，将ECL混合液体覆盖到PVDF上吸附了蛋白的一面，室温下(25℃)反应1min，用平头镊钳住PVDF膜淋去多余的液体。 3.暗室中将PVDF膜置于压片盒中的两层保鲜膜中间，其中吸附有蛋白质的一面朝上，平整地放置在压片盒中。 4.将曝光的胶片放在显影液中显影3min，经过清水冲洗除去显影液后将胶片浸没在定影液中1min。 |
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kobe199613
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感觉显影时间有点长啊，很久不做了，也不是很确定了，还有就是拍照的时候曝光时间，过长的话背景也会很深。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-09-16 09:39:19
3楼2015-09-16 10:49:17
learningying
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可以参考里面的解决方法，或者看看其他公司的western blot trouble shooting |
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