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植物内生菌分离
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我是刚刚接触微生物试验，现在要做一种中药根部内生菌的分离，我做了两次都是对照长菌了，好像是表面消毒不彻底或者是试验技术不过关，我是依次用75酒精5分钟，千分之一升汞15分钟，无菌水漂洗5次，然后切片的。那位高手给指教一下，问题可能是出在哪里？这步试验的注意细节是什么？本人在此谢过了，呵呵 可惜本人只有1个金币无法致谢 [ Last edited by 350784478 on 2009-7-13 at 13:49 ] |
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raindrop8316
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xyklmu(金币+3,VIP+0):积极交流奖
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采用Misaghi（1990）的方法，将田间采集的植株的根和茎基部用清水洗净后，75％酒精表面消毒30s，0.5％NaClO3浸泡10min。无菌水清洗三次。从最后一次的清洗液汲取0.2ml，铺于NA平板，28℃下培养，重复三次；同时，将植株的根系，茎基部剪下，培养皿内4℃保存。48h后，NA平板上如没有细菌生长，则说明表面消毒彻底。则将对应的根系、茎基部组织加10ml无菌水研磨成匀浆，静置10min。取1ml匀浆对数稀释至107。取105、105、107稀释液各0.4ml，铺于四种培养基平板，重复三次，28℃培养48－36h。每皿选择1-3株主要长势旺盛的种群。常规方法纯化后，4℃储藏备用。 Misaghi I J,Donndelinger C R.1990, Endophytic bacteria in symptom-free cotton plants[J].Phytopathology,80:808-811。 |
10楼2008-08-27 11:35:44
raindrop8316
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2楼2008-08-26 16:14:08
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raindrop8316
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reasonspare
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xyklmu(金币+4,VIP+0):分析的很有道理，^_^
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错误有： 首先75% 酒精和升汞都有消毒功能 同时使用就相当于1+1=0 前者消毒，后者消毒，但是同时使用，就会有漏网之鱼。 表面消毒第一步： 消除表面张力，就是说这个步骤就是让后续的消毒处理充分接触组织。 通常用无水乙醇，或者95% 以上。1-5min 接下来，可以选择：75%乙醇15min 0.1%升汞5min 3% 过氧化氢 10min 10%次氯酸钠 15min 你选择酒精5min， 既没有达到彻底杀毒的目的，也没有达到消除表面张力的目的。 也就是说该杀死的没有死，反而给升汞留下死角， 通常升汞不超过5min，就你的protocol而言，再长的时间都有漏网之鱼。 |
8楼2008-08-27 02:47:55
raindrop8316
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9楼2008-08-27 11:32:59
