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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！引物二聚体和目的条带差不多亮，怎么降低二聚体数量啊？
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xiaofan66

[交流] 求助！引物二聚体和目的条带差不多亮，怎么降低二聚体数量啊？

如题：
求助！引物二聚体和目的条带差不多亮，怎么降低二聚体数量啊？采取什么办法能降低引物二聚体的亮度啊？
如果二聚体和目的条带差不多亮，能上DGGE么？
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1楼 2008-08-25 20:30:48
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):积极交流奖
得提高特异性

有三种尝试方法
1提高退火温度
2提高Mg2+浓度
3加入一定浓度的DMSO

如果能进行胶回收，得到你的目的带，有二聚体也没有关系
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2楼2008-08-25 20:53:17
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
xyklmu(金币+4,VIP+0):感谢答复，积极交流奖
提高退火温度是可行的
提高镁离子浓度值得商榷，如果你的体系里头是2.5mM的Mg，那么尝试降低为2.0mM，提高Mg会增加非特异性
DMSO需要摸浓度，一般从3%~5%开始摸，以1%为间隔，DMSO浓度太高会抑制Taq活性。另外，似乎DMSO和Mg也有很纠结的关系……这是我的经验，但我说不出到底是什么关系，反正我习惯做很多组合实验
降低引物浓度也有助于降低dimer
另外，重新设计引物也不失为一个好办法~~~
还有，可以尝试做降落PCR，能够提高目的条带的浓度
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3楼2008-08-25 20:57:52
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
三磷酸腺苷 说的很好很专业
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4楼2008-08-25 21:12:14
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
=v=
我最近做PCR做到快疯了~~~所以自然有很多心得体会
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5楼2008-08-25 21:26:51
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xiaofan66

谢谢各位指点！
今天我提高了退火温度试验了一下，二聚体的浓度确实降低了，没以前那么亮了，可是目的条带也变弱了，呵呵！明儿我在试试。
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6楼2008-08-26 20:25:38
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):积极交流奖
不行就重新设计引物　设计引物要注意两条引物的３端前３个碱基不要互补　再说你可以胶回收　那样就没有问题了么
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7楼2008-08-27 11:41:09
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
引用回帖:
提高镁离子浓度值得商榷，如果你的体系里头是2.5mM的Mg，那么尝试降低为2.0mM，提高Mg会增加非特异性

我个人感觉要降低镁离子的浓度才合适的。还有就是要降低引物的浓度。
这样的pcr产物上DGGE应该是没有问题的，只要是你的pcr产物的量足够的话，胶回收一下会好。
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位卑未敢忘忧国。
8楼2008-09-02 14:34:33
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