| 查看: 4136 | 回复: 41 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
吗子金虫 (小有名气)
|
[交流]
做质粒重组的虫友们请看这
|
||
|
小弟最近一直在构建载体，用的是限制性酶切克隆，之前已顺利构建了一个载体。 但是最近将另一个基因连接于表达载体上的时候，目的基因已经获得并已纯化，表达载体也切开并纯化了， 连接的时候换了各种连接比例，但结果一直是连接不上（用的TAKARA的T4连接酶），已经连续近三个月失败，几近奔溃。亦被老板嫌弃多次。。。 在查了一些资料及请教了一些前辈之后，他们建议选择其他克隆方式，比如无缝连接(In-Fusion Cloning),好像还有相应的重组KIT。 我也打算试试了，不能一棵树上吊死啊。 现抽空发帖与各位做重组的虫友们交流讨论，做得好的，希望大家分享宝贵经验；和我一样苦逼做不出来的也希望互相学习，都是为了试验顺利。  关于质粒重组的好方法希望大家多多发表下宝贵意见吧。50金币大家不要嫌少。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有68人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
小虫子666
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 6474.1
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 756
- 在线: 126.4小时
- 虫号: 846035
- 注册: 2009-09-12
- 性别: GG
- 专业: 植物营养学
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-05 22:59:18
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-05 22:59:18
|
250bp的片段很好连，酶切完了跑电泳的时候时间短点，只要和t载体分开就行，150v，10分钟吧(因为250bp的片段你电泳时间长的话条带就有些发虚了)。还有原因小片段的酶切效率偏低（个人经验），所以你多做酶切的策略是正确的，如果你胶回收得率低，可以讲这些酶切产物胶回收的时候可以分成4份，3个胶块融在一个管里，分别过柱子，最后洗脱的时候可以用30～40ul的洗脱液洗2个柱子（或者3个，4个等），这样提高回收产率。 发自小木虫Android客户端 |
22楼2015-09-02 20:17:23
假大空
木虫之王 (文学泰斗)
- 应助: 996 (博后)
- 金币: 561165
- 散金: 58409
- 红花: 291
- 沙发: 5
- 帖子: 551628
- 在线: 9100.9小时
- 虫号: 1588220
- 注册: 2012-01-27
- 专业: 有机合成
7楼2015-09-02 16:51:21
chenyuanxmc
金虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6428.3
- 散金: 250
- 红花: 3
- 帖子: 1852
- 在线: 129.3小时
- 虫号: 1246427
- 注册: 2011-03-27
- 专业: 免疫生物学
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
|
插入片段和载体的浓度稍微大点进行连接，后期用pcr筛选，祝顺利 发自小木虫Android客户端 |
10楼2015-09-02 16:57:41
13楼2015-09-02 17:26:58
投票:
28