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吗子金虫 (小有名气)
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[交流]
做质粒重组的虫友们请看这
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小弟最近一直在构建载体，用的是限制性酶切克隆，之前已顺利构建了一个载体。 但是最近将另一个基因连接于表达载体上的时候，目的基因已经获得并已纯化，表达载体也切开并纯化了， 连接的时候换了各种连接比例，但结果一直是连接不上（用的TAKARA的T4连接酶），已经连续近三个月失败，几近奔溃。亦被老板嫌弃多次。。。 在查了一些资料及请教了一些前辈之后，他们建议选择其他克隆方式，比如无缝连接(In-Fusion Cloning),好像还有相应的重组KIT。 我也打算试试了，不能一棵树上吊死啊。 现抽空发帖与各位做重组的虫友们交流讨论，做得好的，希望大家分享宝贵经验；和我一样苦逼做不出来的也希望互相学习，都是为了试验顺利。  关于质粒重组的好方法希望大家多多发表下宝贵意见吧。50金币大家不要嫌少。。。。 |
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小虫子666
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-05 22:59:18
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250bp的片段很好连，酶切完了跑电泳的时候时间短点，只要和t载体分开就行，150v，10分钟吧(因为250bp的片段你电泳时间长的话条带就有些发虚了)。还有原因小片段的酶切效率偏低（个人经验），所以你多做酶切的策略是正确的，如果你胶回收得率低，可以讲这些酶切产物胶回收的时候可以分成4份，3个胶块融在一个管里，分别过柱子，最后洗脱的时候可以用30～40ul的洗脱液洗2个柱子（或者3个，4个等），这样提高回收产率。 发自小木虫Android客户端 |
22楼2015-09-02 20:17:23
假大空
木虫之王 (文学泰斗)
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7楼2015-09-02 16:51:21
chenyuanxmc
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吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
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插入片段和载体的浓度稍微大点进行连接，后期用pcr筛选，祝顺利 发自小木虫Android客户端 |
10楼2015-09-02 16:57:41
13楼2015-09-02 17:26:58
