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白色实验服

新虫 (初入文坛)

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[求助] 测定土壤酶活力过程中的问题已有3人参与

小弟最近在测定土壤酶活力，常见的几种酶。像蔗糖酶（比色法）、脲酶（苯酚钠-次氯酸钠比色法）、蛋白酶（茚三酮比色法）、纤维素酶（硝基水杨酸比色法）等……
但是，在测定蛋白酶的时候出现一系列问题如下：
1：1、蛋白酶测定的时候，实验组和对照组（无土+无基质）全部出现茶色，并没有出现应该出现的蓝紫色，做了四次，全部都是茶色，不知道哪里出现问题了；
2、用酪素做基质，波长为500nm，用明胶做基质，波长为560nm，请问到底波长用多少合适？
3、培养结束后，过滤之前还是之后加入沉淀蛋白质的试剂，加入后需不需要离心？离心转速多少？离心在过滤之前还是过滤之后好？
4、没有离心，培养后直接过滤，过滤速度很慢（超级慢的那一种），这个现象合理不合理，如果不合理，该怎么做？
5、用酪素做基质，标准曲线用甘氨酸绘制？还是酪氨酸绘制？明胶做基质曲线用什么绘制呢？（查阅了很多文献，方法有的各不相同，希望大神解答……）
我用茚三酮比色法（酪素基质），测定波长为500nm；加勒斯江法（明胶基质），测定波长为560nm；实验还是不出结果，希望虫友帮助，小弟不胜感激……
在测定纤维素酶活力的时候，出现过滤很慢（无法想象的慢，甚至我怀疑过滤都停止了），不知道离心或者用布氏漏斗可以不可以（今天打算试一下的）……或者虫友有更好的解决办法。
第一次发帖，不便之处请见谅。刚签到三天，金币不多……希望大家能帮小弟解决这些问题，在线等。

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实验服穿到报废！

1楼2015-08-25 10:57:27

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新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 我是一粒沙 at 2015-08-25 14:04:53
不懂楼上的问题，爱莫能助了。想请教一下你的脲酶的测定方法？

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）
1、试剂
1）甲苯；
2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml；
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并（会暴沸，混合时要注意），用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml；
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml；
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定；
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
2、操作步骤
称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。
标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
3、结果计算：
以24小时后1g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。
Ure=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；
V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重