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helenfang

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引用回帖:

Originally posted by jasco at 2008-8-22 09:53:
你要回收的片段大小是？小于100bp的片段，只有qiagen的回收试剂盒能胜任，且回收率也不高，其他盒子没有保障。

大概650bp左右，应该是比较好回收的吧

11楼2008-08-22 14:33:31

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helenfang

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引用回帖:

Originally posted by snzydong at 2008-8-22 10:59:
回收胶呢有很多的原因会影响回收效率：
1.你的胶要做的厚度合适，能刚好把所有的样品都点下，有没有过多的剩余空间。
2.电泳缓冲液也要新配的，或新稀释的。
3.你初始的样品的浓度量要达到，本来就不太大的量， ...

因为条带较多，在目的条带附近就有一条，所以切胶的时间可能是多花了点时间。
我今天打算再做一次回收，用Axygen回收试剂盒再试一次，上次做其他片段回收的时候用这个用的还挺好的，那个用完了就用了这个博大的一个试用装做了，结果。。。
真的非常感谢热心帮助。

12楼2008-08-22 14:38:21

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helenfang

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★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖

非常感谢各位，虽说做个回收、克隆之类的很多人都会，而且也还简单，在这个论坛里也是老生常谈，但对于新手来说可能经验比较欠缺，结果出了问题自己真的不太能分析，在这里这么多人参加讨论下让我受益匪浅，真的非常感谢的。
今天再做一次回收，用Axygen的试剂盒再试一次，看结果如何，到时候再过来汇报。

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13楼2008-08-22 14:41:54

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xiaoyadxy

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★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx

可能是试剂盒回收率太低，建议你换个可靠的盒子。
你电泳点样多少啊？点的少了就是没条带。
我们也遇见过同样问题，后来测了一下DNA浓度，还是有的，40多ng/ul。就往下做了，还可以用。

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14楼2008-08-22 20:02:32

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skkyy88888

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★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx

６０度融完胶了要冷却后再上柱子．效果较好．

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15楼2008-08-22 20:25:31

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connexin

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博大的试剂盒我也出现过这种情况，它的柱子可能有点问题。建议用TAKARA，一般很稳定。

16楼2008-08-23 10:23:00

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helenfang

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昨天将博大试剂盒回收产物再进行了PCR，电泳发现还是有条带的，说明浓度太低了以致电泳都检测不到。我又用Axygen的做了一次回收，电泳检测还是有条带的，虽然浓度也不是很大，可能博大的回收率不高。

17楼2008-08-23 10:47:21

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helenfang

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另外我想请问下大家，如果我的回收产物浓度较低，是不是最好将回收产物再进行一次PCR，再接着做连接呢，连接体系中加入的PCR回收产物的量是按照什么原则来计算的，非常感谢

18楼2008-08-23 10:49:23

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xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复，积极交流

回收产物再次PCR，产生的错配会增多。回收产物浓度低，你可以多做几管再回收。还有你问的最后一步用水的PH问题，可以不管水的PH值，直接用灭菌DDW即可。但得率是否会因此降低，这就不知道了

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19楼2008-08-23 16:22:50

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