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酶切见鬼， chysx6快来
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最近做的一个基因用NcoI克隆居然链接到了HIndIII的位点，查查MBI的目录说NcoI在高浓度甘油下有星号活力，我用得酶浓度确实比较高，为什么MBI标记星号活力的时候没有用图标表示，而只是在说明里面提了一下呢？   |
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xyklmu(金币+4,VIP+0):感谢发帖，积极交流奖
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查了一下 Product NcoI - MBI Description NcoI recognizes the sequence 5'...C/CATGG...3'. 3'...GGTAC/C...5' Star Activity A large excess of the enzyme results in star activity HindIII 5'... A↓A G C T T... 3' 3'... T T C G A↑A ...5' 先解释一下星活性 星号活力：非标准反应条件下，内切酶识别切割能力下降，识别特异性下降。 *eg. EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’ 星号活力产生原因 （甘油、盐、pH、有机试剂） 在不同条件下，酶活性大致分三种状态（粗略理解） 1.正常工作（特异切，活性） 2.非正常工作（乱切，星活性） 3.不工作（不切，失活） 一般酶会因缓冲液不同及各种离子的影响在这三种状态间变化 特异性好的酶，可能就在1与3这两个状态形式多一些，就是或者切或者不切 而有些酶可能会出现状态2的形式 从这个意义上说，任何酶都是可能出现星活性的（在不合适的缓冲条件下） 所以在酶的使用过程中，时刻堤防星活性的出现 具体做法是尽量使用酶的最适buffer 酶量不易过多，因为酶保存液中50% glycerol，而最终酶工作体系中甘油不易超5%，超5%是易引起星活性的 DNA量不易过多，容易引起底物抑制 至于楼主提到”基因用NcoI克隆居然链接到了HIndIII的位点”， 我想可能是非物异的连接吧 就是说任何DNA的磷酸基与羟基都是有可能连接的 这种情况你可以用NcoI、HIndIII分别单切验证，应该都切不开，因为两个位点都死掉了 如果说NcoI的星活性恰好非特异的切出HIndIII位点而连入，好像不大可能，机率太小了 希望说的对你有帮助  |
2楼2008-08-18 17:45:02
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