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cuining423

新虫 (初入文坛)

[求助] 16s DNA鉴定菌种都做不出来!!!拜托各位大神了 已有6人参与

我做16s菌种鉴定,采用通用引物27/1492,直接把LB平板(上有单菌落)拿去测序公司,两家公司,三次测序。结果都是正向双峰,反向正常。我改怎么办,测试公司一直说我菌不纯,可是都是单菌落了呀。还有什么办法吗?通过反向序列BLAST,大概可能是芽孢杆菌属,。我还能怎么办!!!!要连个载体再去送测序公司吗?各位大神帮帮忙了,实验室分子方面不怎么做,跪谢了
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465663473

铜虫 (小有名气)

菌肯定是纯的,不然反向也会出现双峰。
你的问题是正向引物有两个以上匹配位点,所以正常测序的时候测出套峰。
解决方法:
①TA克隆后测序。
②换其他引物,4F等等,16S通用引物一大把,自己找找吧,最好选3’端没有兼并碱基的引物
③500bp到700bp处在设计一个反向测序引物,两个方向引物测通。
9楼2015-08-17 10:01:54
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生态学查建军

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
要不你用试剂盒提取DNA再拿去测序试试看啊,我每次都是提取后再去测序
2楼2015-08-11 11:19:17
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cuining423

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 生态学查建军 at 2015-08-11 11:19:17
要不你用试剂盒提取DNA再拿去测序试试看啊,我每次都是提取后再去测序

这个我也做过,试剂盒提取,然后送测序。可是正向也是双峰,后来没办法,才送的平板单菌落,结果也是一样
3楼2015-08-11 11:30:23
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zkysn

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dllchina: 金币+2, 鼓励应助 2015-08-12 16:22:47
再多纯化几次,有时候你肉眼看到的单菌落,但其实有杂菌的,双峰应该就是不纯的问题,芽孢杆菌应该还是挺好做的,纯化几次后挑单菌落液体培养,然后提DNA,做个PCR再去测序
4楼2015-08-11 17:07:10
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