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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 16s DNA鉴定菌种都做不出来！！！拜托各位大神了
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cuining423

新虫 (初入文坛)

[求助] 16s DNA鉴定菌种都做不出来！！！拜托各位大神了 已有6人参与

我做16s菌种鉴定，采用通用引物27/1492，直接把LB平板（上有单菌落）拿去测序公司，两家公司，三次测序。结果都是正向双峰，反向正常。我改怎么办，测试公司一直说我菌不纯，可是都是单菌落了呀。还有什么办法吗？通过反向序列BLAST，大概可能是芽孢杆菌属，。我还能怎么办！！！！要连个载体再去送测序公司吗？各位大神帮帮忙了，实验室分子方面不怎么做，跪谢了
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1楼 2015-08-11 10:44:25
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生态学查建军

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要不你用试剂盒提取DNA再拿去测序试试看啊，我每次都是提取后再去测序
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2楼2015-08-11 11:19:17
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cuining423

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 生态学查建军 at 2015-08-11 11:19:17
要不你用试剂盒提取DNA再拿去测序试试看啊，我每次都是提取后再去测序

这个我也做过，试剂盒提取，然后送测序。可是正向也是双峰，后来没办法，才送的平板单菌落，结果也是一样
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3楼2015-08-11 11:30:23
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zkysn

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dllchina: 金币+2, 鼓励应助 2015-08-12 16:22:47
再多纯化几次，有时候你肉眼看到的单菌落，但其实有杂菌的，双峰应该就是不纯的问题，芽孢杆菌应该还是挺好做的，纯化几次后挑单菌落液体培养，然后提DNA，做个PCR再去测序
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4楼2015-08-11 17:07:10
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cuining423: 金币+5, ★★★很有帮助, 测序公司今天重新设计引物，反向测通，谢谢大神！！希望明天能拿到结果 2015-08-12 15:40:50
让测序公司设计引物，反向测通，用不了几天的
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5楼2015-08-12 10:58:50
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boy2006

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提高退火温度，也可以做克隆测序，多挑几个菌落送测，这样虽然可以测序成功知道什么菌，但菌还是不纯。
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6楼2015-08-12 11:14:26
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chen9341

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR扩增之后试剂盒纯化一次，再PCR扩增一次，浓度可以翻N个数量级，希望对你有帮助
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7楼2015-08-12 14:38:42
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xulinsoa

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做个TA克隆呗

要不然就不断划线至纯
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8楼2015-08-12 14:42:49
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465663473

铜虫 (小有名气)
菌肯定是纯的，不然反向也会出现双峰。
你的问题是正向引物有两个以上匹配位点，所以正常测序的时候测出套峰。
解决方法：
①TA克隆后测序。
②换其他引物，4F等等，16S通用引物一大把，自己找找吧，最好选3’端没有兼并碱基的引物
③500bp到700bp处在设计一个反向测序引物，两个方向引物测通。
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9楼2015-08-17 10:01:54
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15516735873

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 一个不小心就 at 2015-08-12 10:58:50
让测序公司设计引物，反向测通，用不了几天的

让公司方向测通，能解决正向双峰的问题吗

发自小木虫Android客户端
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天生我才必有用
10楼2016-10-19 10:44:10
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