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xuguang09280036新虫 (初入文坛)
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[交流]
有关载体去磷酸化的
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| 最近做 载体的 去磷酸化 效果不是很好 不知各位高手 都是如何做的？ 我是 直接在50 度，CIAP反应了 一个小时 行吗 ？ 好像 还有37 度 的 一个反应 ，不过没做 ， 不知道 37 度 和 50 度 的 反应的 原理是什么啊 ？？ 谢谢 ！！！ |
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2楼2008-08-16 11:09:47
3楼2008-08-16 13:34:51
xuguang09280036
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
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- 虫号: 535182
- 注册: 2008-03-28
- 性别: GG
- 专业: 口腔颌面组织生物力学和生
4楼2008-08-17 13:24:54
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reasonspare(金币+5,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
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小牛肠碱性磷酸酶(CIP) (Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) ) #M0290V 500 Units 319.00 元 #M0290S 1,000 Units 629.00 元 #M0290L 5,000 Units 2,789.00 元 产品说明：碱性磷酸酶能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5′磷酸基团。由于CIP处理后的DNA片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端，因此它们不能进行自连接(1)。这个特性可以在克隆时降低载体DNA的背景。 来源：小牛肠粘膜。 反应缓冲液： 1X NEBuffer 3 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM DTT (pH 7.9 @ 25°C)。 另外，CIP在NEBuffers 2、NEBuffers 4 以及EcoR I和BamH I的Reaction Buffer中也有活性。 CIP去磷酸化步骤： 将DNA溶在1X NEBuffer (0.5 µg/10 µl)中。 每 µg载体DNA加0.5单位的酶。 37°C温育60 分钟。 通过胶回收、柱离心或酚抽提方法纯化DNA。 质量保证： CIP 由New England Biolabs的芬兰分公司 Finnzymes Oy 所纯化，不含核酸外切酶、核酸内切酶或RNA酶，质量控制检测在Finnzymes Oy公司进行，并经New England Biolabs认证。 单位定义：在1 ml反应体系中，37°C、1分钟催化1 µmol的对-硝基酚磷酸(pNPP)水解成对硝基酚(pNP)所需的酶量定义为一个活力单位(2)。 活性检测条件： 1 M 乙二胺(pH 9.8)，0.5 mM MgCl2，10 mM 对-硝基酚磷酸和适量的酶（这些条件仅用于定量检测酶活力）。 浓度： 10,000 units/ml。 贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2 和50%甘油，-20°C 贮存。 热失活条件: 无 参考文献: 1. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed.), (p. 5.72). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2. Mossner, E., Boll, M. and Pfleiderer, G. (1980) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 361, 543-549. |
5楼2008-08-17 13:59:34