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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 比较糟心的蛋白纯化以及分析问题，求解答~
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蕲螺衣

铜虫 (小有名气)

[求助] 比较糟心的蛋白纯化以及分析问题，求解答~ 已有6人参与

不知道有没有人用过GE公司的HiPrepTM 26/60 SephacrylTM S-200纯化柱，柱体积为320ml，我流速用的1.5ml/min，以下是我的出峰位置，不知道有没有经验丰富的同学能根据该出峰位置来判断蛋白的大小的？另外我做的蛋白是两个蛋白 （20KD和7KD，PS：两个蛋白结合很稳定，也不是二硫键结合，结合比例未知）的复合物，从出峰情况可以看出是几聚体吗？是否有游离的20KD的蛋白存在呢？实验室就我一个人做纯化，而且这个蛋白是要送去做结晶的，但是没有相关经验，希望有经验的虫友能帮忙解答，谢谢！

比较糟心的蛋白纯化以及分析问题，求解答~
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比较糟心的蛋白纯化以及分析问题，求解答~-1
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1楼 2015-08-07 10:19:14
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蕲螺衣: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-08-10 15:49:49
柱子应该有相应的说明书啊，可以去GE官网搜下。看胶感觉像1：1的结合比例，但是具体几聚体不清楚，可以做个分析超离。纯化已经不错了，浓缩点晶体吧
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2楼2015-08-07 10:25:55
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sy0714541

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的SDS-PAGE 是还原的吧！跑个非还原的对照一下
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浦东新区从事生物医药研发，小硕一枚
3楼2015-08-07 14:56:50
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bao可雅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sy0714541 at 2015-08-07 14:56:50
你的SDS-PAGE 是还原的吧！跑个非还原的对照一下

大神，小白求解答，非还原胶是什么意思？
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4楼2015-08-07 16:08:50
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1510050322

银虫 (初入文坛)
你不可以用已知的蛋白marker和样品跑胶来得出分子大小吗？在峰图上可以看到吗？
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5楼2015-08-07 21:48:34
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蕲螺衣

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-08-07 10:25:55
柱子应该有相应的说明书啊，可以去GE官网搜下。看胶感觉像1：1的结合比例，但是具体几聚体不清楚，可以做个分析超离。纯化已经不错了，浓缩点晶体吧

就担心是高聚体，还担心其中有游离的20KD的蛋白，准备去做高效液相看看，谢谢您的回答~
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6楼2015-08-10 15:49:40
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MollyZong

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主你好，不知道你问题解决没有，我也要做蛋白纯化，但是实验室做过的师姐都毕业了，能不能分享点经验，比如你的峰图是怎么做的？谢谢！
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7楼2015-08-11 08:57:51
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sy0714541

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by bao可雅 at 2015-08-07 16:08:50
大神，小白求解答，非还原胶是什么意思？...

胶不用换，只需要将loading buffer换一下就可以！非还原电泳方法： loading buffer里不加巯基乙醇或是DTT ，其他的与还原胶一样的就行   注意 Marker 和样品之间最好空一道，因为Marker是还原性的
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浦东新区从事生物医药研发，小硕一枚
8楼2015-08-11 14:04:44
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蕲螺衣

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sy0714541 at 2015-08-11 14:04:44
胶不用换，只需要将loading buffer换一下就可以！非还原电泳方法： loading buffer里不加巯基乙醇或是DTT ，其他的与还原胶一样的就行   注意 Marker 和样品之间最好空一道，因为Marker是还原性的...

这个有试过，跑出来结果跟变性胶一样，话说巯基乙醇不是打开二硫键的吗?如果是以其他方式结合呢？
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9楼2015-08-14 08:37:07
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你有没有标准蛋白，就是5kD~100KD的标准蛋白混合物，如果有的话，用标准蛋白混合物去跑一下层析柱，然后就知道你的蛋白大致的分子量，再算是几聚物。
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10楼2015-08-17 15:55:18
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