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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因克隆
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weiyounuli

新虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆 已有1人参与

好不容易提取了RNA，可以扩增基因了，但是用软件设计的引物分值很高啊，怎么一个条带都没有？是反应体系的问题还是需要重新设计引物？
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1楼 2015-08-06 15:59:48
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weiyounuli

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-06 17:55:19
有很多原因会导致扩不出来，模板质量、PCR体系、PCR条件等都有可能，不要急着换引物，你说RNA提出来了，质量如何？有电泳图？测浓度、吸光值没有？体系中各试剂是否有效？PCR是否做了阳性对照？要一项项排除。

有，吸光值在四百多，做了反转录验证，试剂应该是有效的，新买的Mix，保存了验证cDNA的电泳图，刚把50微升的体系换成10微升试了试，有一个有微弱的条带，其他的都没有
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3楼2015-08-06 20:10:04
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有很多原因会导致扩不出来，模板质量、PCR体系、PCR条件等都有可能，不要急着换引物，你说RNA提出来了，质量如何？有电泳图？测浓度、吸光值没有？体系中各试剂是否有效？PCR是否做了阳性对照？要一项项排除。
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2楼2015-08-06 17:55:19
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by weiyounuli at 2015-08-06 20:10:04
有，吸光值在四百多，做了反转录验证，试剂应该是有效的，新买的Mix，保存了验证cDNA的电泳图，刚把50微升的体系换成10微升试了试，有一个有微弱的条带，其他的都没有...

“吸光值在四百多”什么意思？提了RNA跑电泳了吗？另外你的目标基因表达是否存在组织特异性、诱导特异性等特点，提RNA的材料是否合适？反转录完，先扩个内参基因看下，也就是阳性对照。
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4楼2015-08-06 22:43:16
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