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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒提取率低
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christine546

铜虫 (初入文坛)

[求助] 质粒提取率低 已有1人参与

质粒小剂量提取过程中，由于操作上的失误，将离心后的上清移到制备管后进行空柱离心，后续仍按protol进行操作，结果浓度为平常浓度的1/4左右。指教仅多出的这一步空柱离心如何影响实验结果？
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苦谁没有呢?
1楼 2015-08-04 23:33:46
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

“吸取上清时从移液枪头看到类似糖浆的物质（感觉浓度挺高的）”这种现象是不正常的，说明你前面的操作有问题。
1.你的菌是新鲜的吗？如果是放在4度冰箱几天后再提质粒，那效率一定低
2.看说明书，你的柱子是否需要平衡
3.加S1后，要彻底悬浮细菌沉淀（如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低）
4.加S2后，轻轻混匀，此时军爷应变得清凉粘稠
5.加S3后，上下翻转6-8次，出现白色絮状沉淀，之后离心得到很 清澈的上清，如果不是这样，说明你前面的操作有问题或试剂盒有问题
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4楼2015-08-06 08:41:32
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
christine546: 金币+5, ★有帮助 2015-08-05 23:15:22
请具体说明你的操作步骤，这样不知道你说的是哪步。
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2楼2015-08-05 08:52:59
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christine546

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-05 08:52:59
请具体说明你的操作步骤，这样不知道你说的是哪步。

Axygen AP-MN-P-50 质粒小量提取试剂盒
加S1,S2,S3后离心，吸取上清时从移液枪头看到类似糖浆的物质（感觉浓度挺高的）；然后，转移到膜上后，空柱离心，再W1,W2洗两回，空柱离心，最后洗脱。
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苦谁没有呢?
3楼2015-08-05 23:13:36
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christine546

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-06 08:41:32
“吸取上清时从移液枪头看到类似糖浆的物质（感觉浓度挺高的）”这种现象是不正常的，说明你前面的操作有问题。
1.你的菌是新鲜的吗？如果是放在4度冰箱几天后再提质粒，那效率一定低
2.看说明书，你的柱子是否需 ...

重新做了一遍，浓度还是80多ug/ul，说明不是个人操作问题。忘了提及摇菌前的菌体是经过保菌处理的。挑菌重新摇上后提取质粒浓度为290ug/ul，基本正常了。
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苦谁没有呢?
5楼2015-08-09 22:06:51
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