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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 1062bp的cDNA中间的一段总是克隆不出来
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bla2013

新虫 (初入文坛)

[交流] 1062bp的cDNA中间的一段总是克隆不出来 已有3人参与

Atggccgcggagctggcgatgggcgccgagctgcccagcagcccgctggccatcgagtacgtcaacgacttcgacctgatgaagttcgaggtgaagaaggagcctcccgaggccgagcgcttctgccaccgcctgccgccaggctcgctgtcctcgacgccgctcagcacgccctgctcctccgtgccctcctcgcccagcttctgcgcgcccagcccgggcaccggcggcggcggcggcgcggggggcggcggcggctcgtctcaggccgggggcgcccccgggccgccgagcgggggccccggcgccgtcgggggcacctcggggaagccggcgctggaggatctgtactggatgagcggctaccagcatcacctcaaccccgaggcgctcaacctgacgcccgaggacgcggtggaggcgctcatcggcagcggccaccacggcgcgcaccacggcgcgcaccacccggcggccgccgcagcctacgaggctttccgcggcccgggcttcgcgggcggcggcggagcggacgacatgggcgccggccaccaccacggcgcgcaccacgccgcccaccatcaccacgccgcccaccaccaccaccaccaccaccaccaccatggcggcgcgggacacggcggtggcgcgggccaccacgtgcgcctggaggagcgcttctccgacgaccagctggtgtccatgtcggtgcgcgagctgaaccggcagctccgcggcttcagcaaggaggaggtcatccggctcaagcagaagcggcgcacgctcaagaaccgcggctacgcgcagtcctgccgcttcaagcgggtgcagcagcggcacattctggagagcgagaagtgccaactccagagccaggtggagcagctgaagctggaggtggggcgcctggccaaagagcgggacctgtacaaggagaaatacgagaagctggcgggccggggcggccccgggagcgcgggcggggccggtttcccgcgggagccttcgccgccgcaggccggtcccggcggggccaagggcacggccgacttcttcctgtag

引物F：GCGCggatccATGGCCGCGGAGCTGGCGATG
     R：GCGCactagtctacaggaagaagtcggccgtgc
这个是我想克隆的cDNA序列和引物，但cgggcaccggcggcggcggcggcgcggggggcggcggcggctcgtctcaggccgggggcgcccccgggccgccgagcgggggccccggcgccgtcgggggcacctcggggaagccggcgctggaggatctgtactggatgagcggctaccagcatcacctcaaccccgaggcgctcaacctgacgcccgaggacgcggtggaggcgctcatcggcagcggccaccacggcgcgcaccacggcgcgcaccacccgg这一部分总是克隆不出来，我用的KOD高保真酶，退货温度从55-80度都试过，这个cDNA是在质粒载体上的。我也尝试过质粒线性化后pcr。我不知道是不是形成大的回文结构，求各位大神支招，谢谢！
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1楼 2015-08-01 16:45:17
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-02 22:21:21
质粒做过测序验证吗？或者做个酶切验证，可能你的质粒就缺失了。有可能是可变剪切。
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2楼2015-08-02 13:13:05
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bla2013

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-02 13:13:05
质粒做过测序验证吗？或者做个酶切验证，可能你的质粒就缺失了。有可能是可变剪切。

质粒没问题，测过序了
赞一下 回复此楼
3楼2015-08-02 17:10:58
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
试试用高GC buffer的聚合酶
赞一下 回复此楼
。
4楼2015-08-02 18:07:10
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个区域是gc-rich，克隆和测序时都要注意加dmso
赞一下 回复此楼
活着就要让人感受到你的存在。
5楼2015-08-02 22:56:34
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bla2013

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xujian568 at 2015-08-02 22:56:34
这个区域是gc-rich，克隆和测序时都要注意加dmso

已经加过了
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6楼2015-08-03 16:45:16
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bla2013

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-08-02 18:07:10
试试用高GC buffer的聚合酶

谢谢，我去试试
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7楼2015-08-03 16:56:24
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bla2013

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-08-02 18:07:10
试试用高GC buffer的聚合酶

p出来了，谢谢
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8楼2015-08-06 14:46:09
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