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princessliu

新虫 (初入文坛)

[求助] 全菌加loading buffer煮样后,出现沉淀,这问题咋解决…… 已有3人参与

求助啊~大肠杆菌诱导表达蛋白后,取全菌和破碎后菌体加还原的6*loading buffer煮样10分钟,出现沉淀。离心,取上清上样,但没有目标蛋白的条带,或是很浅。但以前跑过就不会有沉淀,蛋白量也很高。重配了buffer煮样,一样出现沉淀……这问题咋解决……求助……
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princessliu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-28 09:06:42
可以,但是要确保样品裂解完全...

啥叫裂解完全?你是说菌破碎完全吗?
5楼2015-07-28 09:39:32
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是因为蛋白量太大了,煮了之后变性凝集沉淀,一般都是少量蛋白煮后电泳的。
也有可能是大肠杆菌蛋白表达后的样品没有裂解完全,还有部分细胞或碎片,裂解的时间再长些会好一点,即使出现沉淀,经过4度离心,取上清即可测浓度,跑电泳。
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
2楼2015-07-27 15:51:26
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princessliu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-27 15:51:26
可能是因为蛋白量太大了,煮了之后变性凝集沉淀,一般都是少量蛋白煮后电泳的。
也有可能是大肠杆菌蛋白表达后的样品没有裂解完全,还有部分细胞或碎片,裂解的时间再长些会好一点,即使出现沉淀,经过4度离心,取 ...

那我是否可以取菌样品量少一点,loading buffer加多一点煮样,这样是不是可以避免沉淀?因为我离心后,确实是电泳后染色,明显条带没有以前颜色深了……
3楼2015-07-28 08:20:51
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by princessliu at 2015-07-28 08:20:51
那我是否可以取菌样品量少一点,loading buffer加多一点煮样,这样是不是可以避免沉淀?因为我离心后,确实是电泳后染色,明显条带没有以前颜色深了……...

可以,但是要确保样品裂解完全
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
4楼2015-07-28 09:06:42
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