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princessliu

新虫 (初入文坛)

[求助] 全菌加loading buffer煮样后,出现沉淀,这问题咋解决……已有3人参与

求助啊~大肠杆菌诱导表达蛋白后,取全菌和破碎后菌体加还原的6*loading buffer煮样10分钟,出现沉淀。离心,取上清上样,但没有目标蛋白的条带,或是很浅。但以前跑过就不会有沉淀,蛋白量也很高。重配了buffer煮样,一样出现沉淀……这问题咋解决……求助……
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1510050322

银虫 (初入文坛)

应该是你煮样的温度太高了吧。使得蛋白变性了吧。
7楼2015-07-29 21:49:35
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普通回帖

恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是因为蛋白量太大了,煮了之后变性凝集沉淀,一般都是少量蛋白煮后电泳的。
也有可能是大肠杆菌蛋白表达后的样品没有裂解完全,还有部分细胞或碎片,裂解的时间再长些会好一点,即使出现沉淀,经过4度离心,取上清即可测浓度,跑电泳。
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
2楼2015-07-27 15:51:26
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princessliu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-27 15:51:26
可能是因为蛋白量太大了,煮了之后变性凝集沉淀,一般都是少量蛋白煮后电泳的。
也有可能是大肠杆菌蛋白表达后的样品没有裂解完全,还有部分细胞或碎片,裂解的时间再长些会好一点,即使出现沉淀,经过4度离心,取 ...

那我是否可以取菌样品量少一点,loading buffer加多一点煮样,这样是不是可以避免沉淀?因为我离心后,确实是电泳后染色,明显条带没有以前颜色深了……
3楼2015-07-28 08:20:51
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by princessliu at 2015-07-28 08:20:51
那我是否可以取菌样品量少一点,loading buffer加多一点煮样,这样是不是可以避免沉淀?因为我离心后,确实是电泳后染色,明显条带没有以前颜色深了……...

可以,但是要确保样品裂解完全
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
4楼2015-07-28 09:06:42
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princessliu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-28 09:06:42
可以,但是要确保样品裂解完全...

啥叫裂解完全?你是说菌破碎完全吗?
5楼2015-07-28 09:39:32
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by princessliu at 2015-07-28 09:39:32
啥叫裂解完全?你是说菌破碎完全吗?...

嗯,对,就是这个意思<(^-^)>
还有要注意一下溶液的PH值,如果PH值越接近蛋白等电点,就越容易沉淀。
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
6楼2015-07-28 10:32:56
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咦猪头黄大侠

新虫 (初入文坛)

没遇到过这样的情况,过来取取经
啦啦啦,啦啦啦,我是卖报的小行家
8楼2015-07-30 16:46:09
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princessliu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 1510050322 at 2015-07-29 21:49:35
应该是你煮样的温度太高了吧。使得蛋白变性了吧。

你建议多少度?我一直都是100度10分钟,之前都没出现过这问题,就是菌浓度一高就会出现沉淀,增加loading buffer的比例之后煮样,沉淀会少些,但依旧会出现……怎么办~
9楼2015-07-31 09:32:32
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范范范范

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以在煮样是加一些SDS促溶一下,即配胶使用的SDS溶液,加个5ul就可以了
烦烦烦烦
10楼2015-07-31 10:35:55
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