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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 全菌加loading buffer煮样后，出现沉淀，这问题咋解决……
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princessliu

新虫 (初入文坛)

[求助] 全菌加loading buffer煮样后，出现沉淀，这问题咋解决…… 已有3人参与

求助啊~大肠杆菌诱导表达蛋白后，取全菌和破碎后菌体加还原的6*loading buffer煮样10分钟，出现沉淀。离心，取上清上样，但没有目标蛋白的条带，或是很浅。但以前跑过就不会有沉淀，蛋白量也很高。重配了buffer煮样，一样出现沉淀……这问题咋解决……求助……
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1楼 2015-07-27 14:35:08
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1510050322

银虫 (初入文坛)
应该是你煮样的温度太高了吧。使得蛋白变性了吧。
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7楼2015-07-29 21:49:35
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普通回帖

恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是因为蛋白量太大了，煮了之后变性凝集沉淀，一般都是少量蛋白煮后电泳的。
也有可能是大肠杆菌蛋白表达后的样品没有裂解完全，还有部分细胞或碎片，裂解的时间再长些会好一点，即使出现沉淀，经过4度离心，取上清即可测浓度，跑电泳。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-07-27 15:51:26
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princessliu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-27 15:51:26
可能是因为蛋白量太大了，煮了之后变性凝集沉淀，一般都是少量蛋白煮后电泳的。
也有可能是大肠杆菌蛋白表达后的样品没有裂解完全，还有部分细胞或碎片，裂解的时间再长些会好一点，即使出现沉淀，经过4度离心，取 ...

那我是否可以取菌样品量少一点，loading buffer加多一点煮样，这样是不是可以避免沉淀？因为我离心后，确实是电泳后染色，明显条带没有以前颜色深了……
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3楼2015-07-28 08:20:51
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by princessliu at 2015-07-28 08:20:51
那我是否可以取菌样品量少一点，loading buffer加多一点煮样，这样是不是可以避免沉淀？因为我离心后，确实是电泳后染色，明显条带没有以前颜色深了……...

可以，但是要确保样品裂解完全
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
4楼2015-07-28 09:06:42
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princessliu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-28 09:06:42
可以，但是要确保样品裂解完全...

啥叫裂解完全？你是说菌破碎完全吗？
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5楼2015-07-28 09:39:32
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by princessliu at 2015-07-28 09:39:32
啥叫裂解完全？你是说菌破碎完全吗？...

嗯，对，就是这个意思＜（＾－＾）＞
还有要注意一下溶液的PH值，如果PH值越接近蛋白等电点，就越容易沉淀。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
6楼2015-07-28 10:32:56
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咦猪头黄大侠

新虫 (初入文坛)
没遇到过这样的情况，过来取取经
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啦啦啦，啦啦啦，我是卖报的小行家
8楼2015-07-30 16:46:09
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princessliu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 1510050322 at 2015-07-29 21:49:35
应该是你煮样的温度太高了吧。使得蛋白变性了吧。

你建议多少度？我一直都是100度10分钟，之前都没出现过这问题，就是菌浓度一高就会出现沉淀，增加loading buffer的比例之后煮样，沉淀会少些，但依旧会出现……怎么办~
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9楼2015-07-31 09:32:32
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范范范范

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以在煮样是加一些SDS促溶一下，即配胶使用的SDS溶液，加个5ul就可以了
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烦烦烦烦
10楼2015-07-31 10:35:55
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