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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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guaidiandian

新虫 (小有名气)

[求助] 请问原位杂交的DNA模板怎么制备 已有1人参与

1 原位杂交的引物怎么设计，有啥要求？
2 原位杂交的DNA模板有没有长度限制？
3 做DNA模板时还有什么需要注意的地方？
要是能把做原位杂交DNA模板的全部过程写出来将不胜感激~~~
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1楼 2015-07-21 21:13:34
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么是DNA模板，探针是RNA探针么？
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2楼2015-07-21 21:15:25
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guaidiandian

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-21 21:15:25
什么是DNA模板，探针是RNA探针么？

要做RNA探针先得制作出DNA的模板，然后转录出RNA探针，我用的是pSPT18和pSPT19质粒，RNA聚合酶是SP6/T7。
现在需要用特异性引物扩增出一部分的目的基因序列然后酶切连接至载体，然后将载体再酶切线性化称为用于转录RNA探针的DNA模板。
现在不太明白引物设计有啥要求还有线性化的DNA模板多长比较合适。
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3楼2015-07-21 21:26:08
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by guaidiandian at 2015-07-21 21:26:08
要做RNA探针先得制作出DNA的模板，然后转录出RNA探针，我用的是pSPT18和pSPT19质粒，RNA聚合酶是SP6/T7。
现在需要用特异性引物扩增出一部分的目的基因序列然后酶切连接至载体，然后将载体再酶切线性化称为用于转 ...

跟普通pcr的引物差不多，只是要在5‘端加上酶切位点 。模板就是普通的pcr模板，探针要求大约300-500bp。
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123456
4楼2015-07-22 08:29:33
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guaidiandian

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-22 08:29:33
跟普通pcr的引物差不多，只是要在5‘端加上酶切位点 。模板就是普通的pcr模板，探针要求大约300-500bp。...

不好意思我还不太明白，设计引物只用在5‘端加上酶切位点吗？
我写下详细过程您看对不对，因为第一次做也不是很明白！
1  用目的基因的特征序列设计引物，在上下游引物的5’端分别加上两个不同的载体上有的酶切位点。（问题：这个过程对限制性内切酶有什么要求吗？可以从质粒中直接扩增出所需要的那一部分序列么？）
2 将扩增出的片段和载体直接用酶进行酶切，载体是pSPT18和pSPT19，然后用T4DNA连接酶进行连接，然后转化DH5α大肠杆菌，用amp进行筛选。
3 将成功导入的菌落进行扩增然后提取重组质粒，用载体上的酶切位点将质粒线性化（用能产生5‘突出端的酶进行酶切），产生出制备RNA探针的模板。
这个过程对吗？求指教！
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5楼2015-07-22 11:20:35
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by guaidiandian at 2015-07-22 11:20:35
不好意思我还不太明白，设计引物只用在5‘端加上酶切位点吗？
我写下详细过程您看对不对，因为第一次做也不是很明白！
1  用目的基因的特征序列设计引物，在上下游引物的5’端分别加上两个不同的载体上有的酶切 ...

基本上对，如果你的载体上有两个相反方向的启动子就不用再设计引物时加上酶切位点，如果没有的话要用含有两个相反方向的启动子的载体进行双酶切并连接，然后再进行单酶切。
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6楼2015-07-22 13:12:26
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