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gemini64银虫 (小有名气)
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[交流]
PCR 问题
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做PCR反应在循环结束后要有5-10min延伸反应，目的是让的PCR片段完全延伸。 我要问的是：为什么前面的循环会有延伸不完全的？不是可以根据程序设定每步的时间吗，把前面的时间设好了怎么会有不完全延伸的呢？想不通！！！ |
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3楼2008-08-08 09:02:12
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reasonspare(金币+3,VIP+0):斑斑捧场，蓬荜生辉。
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| 在PCR反应的过程中，有一步延伸的过程，一般我们设计的时间都会大于聚合酶合成整个扩增片段所需要的时间的。Taq我们经常按照每分钟1Kb左右来估算。但这是普遍意义来说的，即平均合成速度。但是，在延伸的过程中，并不是一个聚合酶分子从头至尾会把待扩增的片段合成完的，有时候由于一些未知的原因，聚合酶会从模板上脱落的，甚至会在合成的中间某个位置停顿下来。另外，体内的DNA合成或者说DNA复制过程中，也存在着DNA聚合酶的循环，我们所说的dna合成速度，是指所有的酶分子的平均速度。这样以来，等到了下一个循环开始的时候，变性开始，那些未合成完全的片段也因为温度的升高和模板分开了，形成一些不完整的片段，这样的情况在pcr过程的最初几个循环时较少，越是接近pcr的结束时的几个循环越是容易出现，主要是dna聚合酶的活性也逐渐降低了，底物减少，产物增加所致。 |
2楼2008-08-08 06:37:23
4楼2008-08-08 09:38:31
5楼2008-09-02 09:37:25
