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关于使用TAQMAN绝对定量的问题，block序列的使用 已有1人参与
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我使用taqman对质粒样本（某一种特定的突变，进行检测的时候发现，有假阳性的存在）。具体情况如下 wildtype GGTGGC wildtype GGTGGC G12S AGTGGC G12A GCTGGC G12R CGTGGC G12V GTTGGC G12C TGTGGC G12D GATGGC 由于 1. 本身wildtype与上述突变仅有一个碱基的差异 2. 上述G12S,G12R,G12C三个突变型之间也仅仅存在一个碱基的差异，G12A,G12V,G12D也仅仅存在一个碱基的差异。导致存在探针错配的可能性（即G12S的质粒样本，单克隆获取，放入上述所有探针，每个反应孔1种探针）。事实上我也做了实验，确实存在上述情况（G12S的质粒样本共使用8个孔，每孔放入一种探针，结果发现包含有G12C和G12R探针的反应孔的荧光值很高，且要显著高于其他类型的探针，见附件）。 我咨询了life的技术，说目前TAQMAN MGB探针也无法达到精确区别一个碱基的程度，也就是特异性也不足够好，但是如果实验需要绝对定量，这部分是避不开的。 我看了其他文献中提到的情况：To improve probe discrimination, we included nonfluorescent blockers consisting of 3􏰃-phosphate oligonucleotides in each reaction (see Supplemental Methods in the online Data Supplement). In short, the 4-plex assay contains blockers against mutated sequences targeted in the 5-plex panel and the 5-plex assay contains blockers against mutated sequences targeted in the 4-plex panel.（实际情况就是，分两管进行多重PCR反应，在其中加了探针和引物以外还加了未标记荧光但是3‘磷酸化的序列）， 不知道是否有看到过这种用法？能有具体提供的文献么？life的技术也说看到过，但是具体如何使用不是很清楚。多谢各位大虾了 |
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