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新手请教关于总RNA提取以及琼脂糖凝胶电泳的问题！ 已有2人参与
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各位站友们大家好，我在做苜蓿草chs基因的克隆实验，第一次接触克隆实验，在提取总RNA以及电泳验证其完整性的时候出了很大的问题，提了四天了，每次跑出来的胶都像下面的样子......询问了师兄和师姐，他们因为没做过RNA的实验所以也不太清楚，小弟在此请教各位大侠了！ RNA长度大约是1.2Kbp 下面是我们的实验过程： 总RNA提取： 1.取新鲜的苜蓿草嫩叶分ABCD四组，每组80mg，经1 g·L?1 次氯酸钠消毒15 min 后, 用双蒸水冲洗干净, 放置-20℃冰箱保存过夜 2.实验用研钵用0.1%DEPC水冲洗，放-20℃冰箱预冷 3.实验用烧杯、镊子、刮刀、枪头、EP管在0.1%DEPC溶液中浸泡过夜，第二天放在37℃的烘箱中烘干。（实验室只有37℃烘箱......） 4.组织样本提取：每个样品加三平勺石英砂，用研钵将组织在-20摄氏度冰箱中磨成粉末，四个样品分别加1ml Trizol，放置5分钟 5.每组加0.2ml氯仿，震荡15秒，室温静置2分钟；4摄氏度，12000转离心15分钟（配平用石英砂） 6.取水相于新的离心管，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟；4摄氏度，12000转离心10分钟（配平用异丙醇） 7.弃去上清液，加入1.5ml的75%乙醇，涡旋；4摄氏度，12000转离心5分钟（配平用 75%乙醇） 8.弃去上清液，室温干燥7分钟；将RNA溶于10μL的0.1%DEPC水中，-60℃保存过夜 注：所有试剂均用0.1%DEPC水配制，操作过程戴手套和口罩。每次提完总RNA，EP管底部都有很少的白色沉淀，用0.1%DEPC水可以溶解。 RNA跑胶： 1.将制胶用具用75%乙醇冲洗一遍，晾干备用。 2.电泳槽处理：3%H2O2灌满，室温放置10分钟，0.1%DEPC水冲洗。 3.制胶：称取0.4g琼脂糖粉末，加入放有29.2mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入4mL的5xTBE、6.8mL的甲醛，2.5μl Goldview然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 4.加样：在一个DEPC处理过的，干燥的EP管中混合以下试剂：5xTBE2μl、甲醛3.5μL、甲酰胺10μL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。取6μL加样于凝胶点样孔内。 5.打开电泳仪，100V电泳30分钟 6.电泳结束后通过紫外透视仪观察。 然后跑出来一直都是这样的......今天下午借了学长PCR完了多余的DNA（长度大约为750bp），按照完全一样的电泳条件，和我们提取的放-60℃过夜的RNA一同电泳，结果还是什么都没看到，这到底是总RNA提取有问题呢还是琼脂糖凝胶电泳的问题呢？希望大侠们不吝赐教！  10000407533376.jpg |
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yvonne9044
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