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[交流] 求助TCA沉淀蛋白的具体方法

我表达的蛋白是在培养上清液中，表达的量少，想用TCA来沉淀一下，请问一下具体的操作，另外还有什么更好的方法，请大家帮忙介绍一下，有人推荐使用超滤管，但是管壁上吸附的蛋白损失是不是大呀？谢谢大家了

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1楼 2008-07-30 17:23:08

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peizhilee

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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专业: 生物信息学

TCA沉淀方法：
1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。
2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。
3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。
4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。用10ul枪头尽量吸去管底残余的液体
5.加入500ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。
6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体
7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。
8.加入20－50ul Loading buffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个
操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。如果蓝色的Loading buffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。