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zx1984

木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白纯化 已有3人参与

我冬天在室温用阴离子柱纯化的很好的蛋白，为什么现在纯化不出来了？冬天室温在10℃左右，现在室温25℃左右，平时柱子就在屋子里放着（大概30℃左右）。是不是温度太高对纯化有影响？还是其它原因？请诸位多多指点！谢谢！
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1楼 2015-06-18 16:43:04
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zx1984: 金币+2 2015-06-19 11:13:31
温度高对蛋白纯化柱没有太大的影响，但是对蛋白的影响较大，容易造成蛋白降解的情况，你的胶跑的怎么样？
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-06-19 10:54:05
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zx1984

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-06-19 10:54:05
温度高对蛋白纯化柱没有太大的影响，但是对蛋白的影响较大，容易造成蛋白降解的情况，你的胶跑的怎么样？

胶跑的没问题，就是纯化效果不好了。
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3楼2015-06-19 11:13:34
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
温度高的话，如果你的目的蛋白不稳定，容易降解。你的杂带有可能是目的蛋白的降解条带。你可以作业个WB看一下，杂带是否和你的抗体反应，如果杂带也反应的话，说明你的目的蛋白降解了。在冰上操作一次吧。看看能不能好些。还有一个问题，就是把你的洗脱体积加大，这样虽然纯化的目的蛋白浓度会低些，纯度会有所改善，最后浓缩一下就可以。
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4楼2015-06-19 11:27:15
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zx1984 at 2015-06-19 11:13:34
胶跑的没问题，就是纯化效果不好了。...

额，我是问Western blot，蛋白是不是有降解的情况？有一种办法可以减少降解的影响，冰上低温操作不一定都有这个条件，你可以在打着空调低温时，加快收集速度，这样可以比较好的避免降解。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
5楼2015-06-19 13:27:46
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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zx1984: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2015-06-19 17:19:02
如果你用Tris作为buffer的话，它的pH值会随着温度显著变化，看看有没有这方面的原因
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2015-06-19 13:50:32
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zx1984

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-06-19 13:27:46
额，我是问Western blot，蛋白是不是有降解的情况？有一种办法可以减少降解的影响，冰上低温操作不一定都有这个条件，你可以在打着空调低温时，加快收集速度，这样可以比较好的避免降解。...

谢谢，我准备在层析柜中重做，我不做western，就是做个了SDS-PAGE,没怎么降解
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7楼2015-06-19 17:20:36
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