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求助GR-DTNB循环法测定谷胱甘肽库的一些问题
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| 最近在测植物组织中谷胱甘肽库的量，采用的是分光光度计测定412nm处的吸光值。基本原理同GSH测定，在此基础上加入GR酶将GSSG还原成GSH，循环反复致使产物TNB增加，吸光值增加。方法中写GSH和GSSG交替，总量不变。要测定3min时的吸光值，有的测定的是4min时的吸光值，想问为什么是3或4min，这个时间是怎么确定的？我在测定时发现3min后吸光值还是在增加的，但一定时间后开始下降。已经做了谷胱甘肽的标准曲线，是将3min时的吸光值带入还是将3min内吸光值的变化率带入求得的是谷胱甘肽库？求大神帮忙答疑解惑，小生不胜感激！ |
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2楼2015-06-04 21:33:22
1012203014
金虫 (正式写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
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- 虫号: 1349300
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- 性别: GG
- 专业: 化学反应工程
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 |
3楼2015-10-07 21:17:14
