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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于PCR的问题
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andygu

[交流] 关于PCR的问题

我手头上有两个东西,A和B.
小P的时候A和B都P出来了.
随后大P.
第一次两个都没P出来,第二次A被P出来了，B没有,第三次B被P出来了，A没有。
郁闷。
我小P用的是20UL体系，大P用的是100的.
20UL体系如下:
模板0.2UL
4*的dNTP 0.4UL
UP 2UL
DOWN 2UL
TAQ 0.2UL
BUFFER 2UL
DDH2O 12UL
Mg2+(25mM) 1.2UL
条件:
94度 5分钟
94度 50秒
61度 50秒
72度 90秒
72度 5分钟

哪里会出问题呢?
谢谢!
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1楼 2008-07-18 08:54:44
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weiwei1

木虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
20UL体系,UP和DOWN是不是太多了，个人认为一般用1就够了。你的片段多长呢？需要61度 50秒。最后的72度 5分钟，延长至10分钟试试。
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2楼2008-07-18 09:10:22
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
那就用小体系多做两管，一起回收
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3楼2008-07-18 09:29:07
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andygu

引用回帖:
Originally posted by weiwei1 at 2008-7-18 09:10:
20UL体系,UP和DOWN是不是太多了，个人认为一般用1就够了。你的片段多长呢？需要61度 50秒。最后的72度 5分钟，延长至10分钟试试。

可是小P P出来了.
只是大P没有P出来.
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4楼2008-07-18 09:54:01
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allen8368

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
引用回帖:
Originally posted by weiwei1 at 2008-7-18 09:10:
20UL体系,UP和DOWN是不是太多了，个人认为一般用1就够了。你的片段多长呢？需要61度 50秒。最后的72度 5分钟，延长至10分钟试试。

引物的用量是有点多 变性和退火时间都有点长  建议模板量可以适当提高一点
比方说1  
还有就是一定要做阴性对照 像你这种有时候P的出来有时候又没有的情况 必须设立严格的阴性对照
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慢慢的认识你，再慢慢的忘记你...........
5楼2008-07-18 15:21:36
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shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白
你的大体系的用量是怎么样的？
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我就是玉树临风胜潘安，一朵梨花压海棠的×××
6楼2008-07-18 15:27:30
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figo.339

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
我感觉应该是酶的问题，因为你加的是0.2ul的酶，而你做100ul时加的是它的五倍，我不知道你配的时候是不是先把酶加进混合管。因为0.2很小，有时候枪头上挂的就有好多，建议你做20的体系，多做几管回收。
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7楼2008-07-18 22:28:36
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logan2929

铜虫 (小有名气)
reasonspare(金币+0,VIP+0):估计看到你的问题人不多，还是修改题目吧。让人明白你要问什么。
借宝地问下，体系中Mg2+对于不同模板有什么要求，我看有的要求无Mg2+，有的要求有Mg2+。
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8楼2008-07-23 23:03:13
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wolong1984

银虫 (小有名气)
增大了体积，各步骤地时间是否会有影响呢，建议延长退火的时间
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9楼2008-07-27 13:31:56
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mingtianhx

新虫 (初入文坛)
反应体系摸索好之后不能随便更改，2楼说的对，可以多P几管
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10楼2008-08-04 12:22:23
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