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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆问题
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yydr

新虫 (初入文坛)

[求助] TA克隆问题 已有3人参与

为什么我回收的片段没有杂带，最后连上载体以后跑胶看不是空载，用pcr扩增目的片段却不是我的目的片段大小呢？

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1楼 2015-05-16 17:00:15
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
挑了几个转化子？是不是在电泳或者回收时污染了其它含有A尾巴的DNA片段了？
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yydr
2楼2015-05-16 19:14:49
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yydr

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
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2楼: Originally posted by cuihao102 at 2015-05-16 19:14:49
挑了几个转化子？是不是在电泳或者回收时污染了其它含有A尾巴的DNA片段了？

可是我跑胶回收后条带很单一啊

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3楼2015-05-16 21:29:11
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-18 23:08:02
引用回帖:
3楼: Originally posted by yydr at 2015-05-16 21:29:11
可是我跑胶回收后条带很单一啊
...

所谓污染不一定达到能看见的量，如果运气比较差的话只有一点其它DNA就有可能给连上了，就被你挑到了！所以推荐你多挑些转化子去验一下！

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yydr
4楼2015-05-16 21:46:46
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xiaocai611

新虫 (初入文坛)
差了多少？你可以把克隆菌拿去把目的片分段测序下
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5楼2015-05-16 22:13:07
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yydr

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cuihao102 at 2015-05-16 21:46:46
所谓污染不一定达到能看见的量，如果运气比较差的话只有一点其它DNA就有可能给连上了，就被你挑到了！所以推荐你多挑些转化子去验一下！
...

我把转化子都挑了，其他都是空载，只有这个是连上的，大小还不对……这运气是要有多差

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6楼2015-05-16 23:38:06
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yydr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaocai611 at 2015-05-16 22:13:07
差了多少？你可以把克隆菌拿去把目的片分段测序下

目的1.2，扩出来的750到1k间，

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7楼2015-05-16 23:39:40
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daniel1112

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-18 23:08:26
你是用通用引物还是特异引物跑的菌液pcr，若是通用引物的话建议用特异引物扩增，要是还有带的话只有测序检测了，有长度多态性的现象。

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8楼2015-05-16 23:39:47
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yydr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by daniel1112 at 2015-05-16 23:39:47
你是用通用引物还是特异引物跑的菌液pcr，若是通用引物的话建议用特异引物扩增，要是还有带的话只有测序检测了，有长度多态性的现象。

我是用的自己的特异引物扩的，扩了两次都一样

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9楼2015-05-17 00:19:18
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yydr at 2015-05-16 23:38:06
我把转化子都挑了，其他都是空载，只有这个是连上的，大小还不对……这运气是要有多差
...

如果你只是想做个克隆，那就别纠结这个了，调整一下连接体系重新连接转化吧！另外你挑了那么多，除了这个都是自连可能你的提载体质量是不是不太好啊？

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10楼2015-05-17 09:15:18
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