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superarm

金虫 (正式写手)

[交流] 没有IPTG诱导能表达出目的蛋白吗?

我用的是pet32载体,表达菌株是BL21,表达的目的蛋白应该为43KD左右吧(目的蛋白21kd,载体融合部分大概23kd吧)融合部分不知道如何计算,我看文献上估计PET32为23kd,结果没有诱导和诱导3h后的电泳图谱在不到45kd处都有比较浓的条带(跟其他条带比最浓)。不知是不是目的蛋白,大小基本符合,但为什么未诱导的也有条带呢?我看其他文献和我表达相同的蛋白在没有诱导的情况下也有条带。
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ypan

木虫 (著名写手)


superarm(金币+1,VIP+0):谢谢你的回答
IPTG是诱导剂,理论上说不加IPTG就不可能诱导,目的蛋白也就表达不出来。根据本人的实验经验,这种表达载体在实际中不加IPTG也会有表达,只要时间稍微长一点就会有表达,比如说在OD600=0.6时本应该诱导,但是没有加入,而继续培养约4个小时之后,还是有表达的,而且比本地水平还要高,但是相比用IPTG诱导的效果要差!实验中没有绝对!
另外pET32a表达融合蛋白的预计分子量要在目的蛋白分子量上加上trx的分子量20.4KD。
祝你好运!
3楼2008-07-16 11:19:35
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jasco

木虫 (正式写手)


superarm(金币+1,VIP+0):谢谢你的回答
pet32a是trx融合表达的载体,你可以把你的序列插入32a序列中,找到表达的orf

培养基的yeast extract中含有少量的乳糖,当然会有诱导作用啦,novagen的不用iptg诱导的自诱导培养基就是这个原理啊

[ Last edited by jasco on 2008-7-16 at 09:14 ]
2楼2008-07-16 09:13:08
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figo.339

木虫 (著名写手)

IPTG诱导蛋白产生,如果你想要目的蛋白的话应该加的。
4楼2008-07-16 12:46:42
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


superarm(金币+1,VIP+0):谢谢你的回答
乳糖操纵子不是说没乳糖就绝对关闭基因
阻遏物对操纵区的结合并不是solid的,而是一个热动力学的过程,分子是运动的、碰撞的
这并不是抗原-抗体一类的共价强结合作用力
因此是有一点点本底表达的
另外,如果你的培养基里头含有少量乳糖,那么就本身就是一个诱导剂了
5楼2008-07-16 14:12:28
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