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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 没有IPTG诱导能表达出目的蛋白吗？
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superarm

金虫 (正式写手)

[交流] 没有IPTG诱导能表达出目的蛋白吗？

我用的是pet32载体，表达菌株是BL21，表达的目的蛋白应该为43KD左右吧（目的蛋白21kd，载体融合部分大概23kd吧）融合部分不知道如何计算，我看文献上估计PET32为23kd，结果没有诱导和诱导3h后的电泳图谱在不到45kd处都有比较浓的条带（跟其他条带比最浓）。不知是不是目的蛋白，大小基本符合，但为什么未诱导的也有条带呢？我看其他文献和我表达相同的蛋白在没有诱导的情况下也有条带。
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1楼 2008-07-15 23:53:07
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jasco

木虫 (正式写手)
★
superarm(金币+1,VIP+0):谢谢你的回答
pet32a是trx融合表达的载体，你可以把你的序列插入32a序列中，找到表达的orf

培养基的yeast extract中含有少量的乳糖，当然会有诱导作用啦，novagen的不用iptg诱导的自诱导培养基就是这个原理啊

[ Last edited by jasco on 2008-7-16 at 09:14 ]
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2楼2008-07-16 09:13:08
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ypan

木虫 (著名写手)
★
superarm(金币+1,VIP+0):谢谢你的回答
IPTG是诱导剂，理论上说不加IPTG就不可能诱导，目的蛋白也就表达不出来。根据本人的实验经验，这种表达载体在实际中不加IPTG也会有表达，只要时间稍微长一点就会有表达，比如说在OD600=0.6时本应该诱导，但是没有加入，而继续培养约4个小时之后，还是有表达的，而且比本地水平还要高，但是相比用IPTG诱导的效果要差！实验中没有绝对！
另外pET32a表达融合蛋白的预计分子量要在目的蛋白分子量上加上trx的分子量20.4KD。
祝你好运！
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3楼2008-07-16 11:19:35
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figo.339

木虫 (著名写手)
IPTG诱导蛋白产生，如果你想要目的蛋白的话应该加的。
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4楼2008-07-16 12:46:42
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
superarm(金币+1,VIP+0):谢谢你的回答
乳糖操纵子不是说没乳糖就绝对关闭基因
阻遏物对操纵区的结合并不是solid的，而是一个热动力学的过程，分子是运动的、碰撞的
这并不是抗原-抗体一类的共价强结合作用力
因此是有一点点本底表达的
另外，如果你的培养基里头含有少量乳糖，那么就本身就是一个诱导剂了
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5楼2008-07-16 14:12:28
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mark32280667806

一般来说，只要不是严谨性调控的，都有本底表达，你用的Bl21(ED3)是非严谨性调控的，所以有表达也很正常。如果想要对照没有表达，可以用质粒空载作为对照。此外也可以用Bl21(ED3)（plysS plysE）等严谨性调控的菌株！！！！
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6楼2008-07-16 20:38:52
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卡宾

木虫 (正式写手)
最好还是把融合蛋白的分子量算清楚。你用BL21，在40K左右会有很深的条带，诱不诱导都有，应该算本身菌的蛋白。TrxA本身的分子量是14K，加上pet32质粒的还有其他氨基酸，所以分子量不一定在40K。根据你的情况，有可能没分开，也有可能是没有表达。
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7楼2008-07-17 09:14:43
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