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关于平端连接
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最近在做平端连接，但是一直连不上，想要分析原因，于是做了一个最简单的对照试验，酶切质粒后补平直接进行自连。想要确定自己的试验体系或操作是否有问题。可是居然对照试验也没有成功，请做过平端连接虫友们帮忙分析一下原因。 对照试验的思路为： Hind III和EcoR I酶切质粒pMD18-T，胶回收，T4 DNA聚合酶补平，然后T4 DNA连接酶连接，最后取全部连接产物转化大肠杆菌感受态。 具体操作步骤： （内切酶、聚合酶、连接酶均购自宝生物） 1) Hind III与EcoR I酶切质粒pMD18-T，胶回收，DNA浓度仪测得回收片段浓 度为0.03μg\μl。 2)T4 DNA聚合酶补平：DNA片段：6μl 聚合酶buffer：1μl 0.1% BSA：1μl dNTP：1μl 配置好后在70℃水浴5min，移入37℃温箱放置10min。 加入1μl的聚合酶，用移液枪轻轻混合，37℃温箱放置5min。 漩涡2000转使酶失活，70℃水浴10min 3)T4 DNA 连接酶连接 DNA 片段(补平的10μl体系不做任何处理)：10μl 连接酶buffer： 2.5μl 连接酶： 2μl ddH2O： 10.5μl 22℃反应22h 4)取连接体系25μl样直接转化大肠杆菌感受态。 不必针对我的这个对照试验，虫友们有好的关于平端连接的经验也说下哈！ [ Last edited by 350784478 on 2009-7-16 at 21:01 ] |
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