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梵天傲

金虫 (小有名气)

[交流] 关于平端连接

最近在做平端连接，但是一直连不上，想要分析原因，于是做了一个最简单的对照试验，酶切质粒后补平直接进行自连。想要确定自己的试验体系或操作是否有问题。可是居然对照试验也没有成功，请做过平端连接虫友们帮忙分析一下原因。
对照试验的思路为：
Hind III和EcoR I酶切质粒pMD18-T，胶回收，T4 DNA聚合酶补平，然后T4 DNA连接酶连接，最后取全部连接产物转化大肠杆菌感受态。
具体操作步骤：
（内切酶、聚合酶、连接酶均购自宝生物）
1)  Hind III与EcoR I酶切质粒pMD18-T，胶回收，DNA浓度仪测得回收片段浓  
    度为0.03μg\μl。
2)T4 DNA聚合酶补平：DNA片段：6μl
                               聚合酶buffer：1μl
                               0.1% BSA：1μl
                              dNTP：1μl
   配置好后在70℃水浴5min，移入37℃温箱放置10min。
  加入1μl的聚合酶，用移液枪轻轻混合，37℃温箱放置5min。
  漩涡2000转使酶失活，70℃水浴10min
3)T4 DNA 连接酶连接
  DNA 片段(补平的10μl体系不做任何处理)：10μl
                                  连接酶buffer：   2.5μl
                                  连接酶：         2μl
                                  ddH2O：        10.5μl
22℃反应22h
4)取连接体系25μl样直接转化大肠杆菌感受态。         

不必针对我的这个对照试验，虫友们有好的关于平端连接的经验也说下哈！

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-16 at 21:01 ]
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1楼 2008-07-14 20:55:19
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
从步骤上来说，感觉是合理的。
怀疑是你的连接体系有问题，是不是连接酶的活性不行？
你可以用EcoRI或者HindIII单酶切质粒，纯化好了以后，再连接，看看你的连接酶是否有活性？
赞一下 回复此楼
位卑未敢忘忧国。
2楼2008-07-15 04:02:54
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月月大可

木虫 (著名写手)
平连确实很困难，一个师兄做平连做了两个多月无果，无奈之下调整实验方案，变为粘连，容易多了。
可以用连接试剂盒，效率高很多！好像还有专门连平端的。
赞一下 回复此楼
3楼2008-07-15 20:03:52
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