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重金求解双荧光素酶报告系统内参不平已有2人参与
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每次实验都这样 疯了 一旦有有效答案 500金币亲手奉上 说下具体的试验设计，这样比较好讨论。 试验目的是要证明启动子对不同激素的应答，将启动子构建在pGL3载体上，转染细胞12h后用激素处理，内参质粒用pRL-TK，2个质粒共转染。48h后离心取上清测定酶活。 转染体系是：1ug； pRL 0.1ug。 设三组平行试验，三组试验测出的值Luciferase/内参值及其不稳定，重复多次都是这样，举个例子，这个还算是差的比较少的一组了。 Luciferase 内参 比值 平行一 Luciferase 15971 16904.3 16269.4 内参 288.004 22 48.0001 平行2 Luciferase 28809.6 31550.8 32212.6 内参 162.001 30 60.0002 大家试验过程中有遇到过相同的问题吗？我的试验步骤已经写的很详细了，哪位高手看着要是发现是什么地方出了问题，劳烦指教一下。 另外又一个疑问：按照双荧光素检测的原理来看，有了pRL质粒作为内参的话，是可以去除试验之间存在的误差，如细胞数目，转染效率之间的差异，按这样的说法，那多次重复试验测的值应该是差不多，并且具有比较性的，可是我重复试验的值完全不具有重复性，内参波动非常的大，连波动的趋势上来看都不具有重复性，这是什么原因？ |
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2楼2015-05-07 10:37:51
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ankang0910
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你选择的是DLR吗？那么II值只有两，三位数就太低了。一般tk绝对值至少4位数以上，基底值都有100左右，你只有二三十我认为不合理啊。可能原因我猜测有这么几点：一是你的转染效率太低了，按说tk0.1ug已经不少了，可值这么低，我想应该是没转进去吧。可以转染荧光质粒看一下效率。二是有可能你的激素或者是转染方法、脂质体什么的对细胞毒性较大，导致细胞活性丧失，数值不稳定。哈哈，供你参考，不求加分，祝你实验顺利。有不对的地方请大神指正，谢谢。 [ 发自小木虫客户端 ] |
4楼2015-05-07 23:24:54
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当然是同时转的啦。步骤就是lip2000的说明书。的确，一般情况下I值比II值容易出问题，但转染效率或是细胞毒性的效应我觉得主要看2值，1值不明显，因为2值是淬灭萤火虫荧光素酶后纯内参值，1值就复杂的多，你构建的启动子活性可能不用刺激，本身值就很大，所以单从1值不好分析。tk应该是买的promega的吧？不行重新转化一下，再提一次，是不是内毒素没去好？想知道楼主用的什么细胞。 [ 发自小木虫客户端 ] |
6楼2015-05-08 12:30:51
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