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谁呀你是谁呀

金虫 (小有名气)

[求助] 重金求解双荧光素酶报告系统内参不平已有2人参与

每次实验都这样 疯了 一旦有有效答案 500金币亲手奉上
说下具体的试验设计,这样比较好讨论。
试验目的是要证明启动子对不同激素的应答,将启动子构建在pGL3载体上,转染细胞12h后用激素处理,内参质粒用pRL-TK,2个质粒共转染。48h后离心取上清测定酶活。
转染体系是:1ug; pRL 0.1ug。

设三组平行试验,三组试验测出的值Luciferase/内参值及其不稳定,重复多次都是这样,举个例子,这个还算是差的比较少的一组了。
Luciferase 内参 比值
平行一
Luciferase 15971        16904.3        16269.4   
  内参      288.004 22        48.0001

       
平行2
Luciferase 28809.6        31550.8        32212.6
内参     162.001        30        60.0002

大家试验过程中有遇到过相同的问题吗?我的试验步骤已经写的很详细了,哪位高手看着要是发现是什么地方出了问题,劳烦指教一下。
另外又一个疑问:按照双荧光素检测的原理来看,有了pRL质粒作为内参的话,是可以去除试验之间存在的误差,如细胞数目,转染效率之间的差异,按这样的说法,那多次重复试验测的值应该是差不多,并且具有比较性的,可是我重复试验的值完全不具有重复性,内参波动非常的大,连波动的趋势上来看都不具有重复性,这是什么原因?
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等等等等
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wjykycg

铁杆木虫 (正式写手)

第二步反应时间不够,没混匀
2楼2015-05-07 10:37:51
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wjykycg

铁杆木虫 (正式写手)

送红花一朵
Sample Text
3楼2015-05-07 10:45:03
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
谁呀你是谁呀: 金币+50, 有帮助 2015-05-08 09:52:38
你选择的是DLR吗?那么II值只有两,三位数就太低了。一般tk绝对值至少4位数以上,基底值都有100左右,你只有二三十我认为不合理啊。可能原因我猜测有这么几点:一是你的转染效率太低了,按说tk0.1ug已经不少了,可值这么低,我想应该是没转进去吧。可以转染荧光质粒看一下效率。二是有可能你的激素或者是转染方法、脂质体什么的对细胞毒性较大,导致细胞活性丧失,数值不稳定。哈哈,供你参考,不求加分,祝你实验顺利。有不对的地方请大神指正,谢谢。

[ 发自小木虫客户端 ]
实验顺利!!
4楼2015-05-07 23:24:54
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谁呀你是谁呀

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ankang0910 at 2015-05-07 23:24:54
你选择的是DLR吗?那么II值只有两,三位数就太低了。一般tk绝对值至少4位数以上,基底值都有100左右,你只有二三十我认为不合理啊。可能原因我猜测有这么几点:一是你的转染效率太低了,按说tk0.1ug已经不少了,可值 ...

可是两个质粒是同时转的呀 I值就很正常 II转的是sv40,活性丧失的话应该I值也很低才对呀 不过还是感谢您的回复
能不能把你转染细胞和测定酶活的详细步骤给我一个呀?我分析分析到底哪儿出问题了
等等等等
5楼2015-05-08 09:51:38
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
谁呀你是谁呀: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-05-08 23:22:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by 谁呀你是谁呀 at 2015-05-08 09:51:38
可是两个质粒是同时转的呀 I值就很正常 II转的是sv40,活性丧失的话应该I值也很低才对呀 不过还是感谢您的回复
能不能把你转染细胞和测定酶活的详细步骤给我一个呀?我分析分析到底哪儿出问题了...

当然是同时转的啦。步骤就是lip2000的说明书。的确,一般情况下I值比II值容易出问题,但转染效率或是细胞毒性的效应我觉得主要看2值,1值不明显,因为2值是淬灭萤火虫荧光素酶后纯内参值,1值就复杂的多,你构建的启动子活性可能不用刺激,本身值就很大,所以单从1值不好分析。tk应该是买的promega的吧?不行重新转化一下,再提一次,是不是内毒素没去好?想知道楼主用的什么细胞。

[ 发自小木虫客户端 ]
实验顺利!!
6楼2015-05-08 12:30:51
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谁呀你是谁呀

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ankang0910 at 2015-05-08 12:30:51
当然是同时转的啦。步骤就是lip2000的说明书。的确,一般情况下I值比II值容易出问题,但转染效率或是细胞毒性的效应我觉得主要看2值,1值不明显,因为2值是淬灭萤火虫荧光素酶后纯内参值,1值就复杂的多,你构建的 ...

我做的昆虫胚胎细胞 脂质体介导的转染
等等等等
7楼2015-05-08 14:40:11
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wjykycg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
谁呀你是谁呀: 金币+400, ★★★★★最佳答案, 我擦 果然 2015-05-08 23:22:07
nono2009: 金币-380, 马甲存档, 请认真阅读:http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=1996653 2015-05-09 07:20:31
第二步反应时间不够,没混匀
8楼2015-05-08 23:14:55
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