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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物设计
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惊叹号

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-05 11:05:48
^_^  扩增全场的设计最简单了
不知道你用那个软件 我一直用primer5
点primer之后，先点击S即正向引物，先在序列最前端点一下，然后用EDIT删除3'端碱基至合适的长度，退火温度，产看错配情况
然后点击A即反向引物 ...

再请教一下，如何选择质粒上的酶切位点？是不是只要目的基因上不含该位点就可以。
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11楼2015-05-05 15:26:37
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
惊叹号: 金币+10 2015-05-05 16:34:40
本帖内容被屏蔽
12楼2015-05-05 15:32:39
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, ★★★很有帮助, 非常感谢 2015-05-05 16:32:30
上传一份资料，第一板块对你有用
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  • 附件 1 : 分子生物学专题手册.pdf
    • 2015-05-05 16:01:40, 1.02 M
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
13楼2015-05-05 16:01:58
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惊叹号

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-05 15:32:39
两点
一点是目的基因上不含该酶切位点
第二点是质粒上多克隆位点有这个酶切位点

此外还要注意正反顺序哈...

能不能讲解一下需要怎么注意正反顺序？
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14楼2015-05-05 16:34:32
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
大家帮我看一下这对引物设计的合不合理
CDS序列
atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc cagacctggg cgg gctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggt ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccg gttctc
acaccgtcca gaggatgtat ggctgcgacg tggggtcgga ctggcgcttc ctccgcgggt accaccagta cgcctacgac ggcaaggatt acatcgccct gaaagaggac ctgcgctctt ggaccgcggc ggacatggca gctcagacca ccaagcacaa gtgggaggcg gcccatgtgg cggagcagtt gagagcctac ctggagggca cgtgcgtgga gtggctccgc agatacctgg agaacgggaa ggagacgctg cagcgcacgg acgcccccaa aacgcatatg actcaccacg ctgtctctga ccatgaagcc accctgaggt gctgggccct gagcttctac cctgcggaga tcacactgac ctggcagcgg gatggggagg accagaccca ggacacggag ctcgtggaga ccaggcctgc aggggatgga accttccaga agtgggcggc tgtggtggtg ccttctggac aggagcagag atacacctgc catgtgcagc atgagggttt gcccaagccc ctcaccctga gatgggagccg tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaagg agggagctac tctcaggctg caagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc acagcttgta aagtgtga
载体：EGFP-N2
酶切位点：EcoRI,BamHI
引物序列：
F：5`-CG GAA TTC ATG GCC GTC ATG
R:  5`-CG GGA TCC TCA CAC TTT ACA AGC TG
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15楼2015-05-05 21:25:37
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ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
谁说平末端不能用了？瞎说~不要误导人！
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ONLY I CAN !
16楼2015-05-06 17:01:59
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ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
惊叹号: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-05-06 17:32:15
引用回帖:
15楼: Originally posted by 惊叹号 at 2015-05-05 21:25:37
大家帮我看一下这对引物设计的合不合理
CDS序列
atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc cagacctggg cgg gctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc cgcggggagc cccgcttc ...

上游引物有点短了吧。和模版完全相合的才12bp太少了。最好提到17个以上。以保证特异性。
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惊叹号
ONLY I CAN !
17楼2015-05-06 17:04:39
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ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 惊叹号 at 2015-05-05 21:25:37
大家帮我看一下这对引物设计的合不合理
CDS序列
atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc cagacctggg cgg gctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc cgcggggagc cccgcttc ...

另外保护性碱基尽量选最多的。可以选3个就不选两个。有些特殊情况， 少了会有问题。
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ONLY I CAN !
18楼2015-05-06 17:06:14
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by ltf329395464 at 2015-05-06 17:04:39
上游引物有点短了吧。和模版完全相合的才12bp太少了。最好提到17个以上。以保证特异性。...

问题是后面全是GC了，没办法再加了啊
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19楼2015-05-06 17:32:44
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