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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 为什么我的RT-PCR老是扩不到目的条带
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 为什么我的RT-PCR老是扩不到目的条带

请教大家，我做植物基因的反转录PCR，总RNA提出来后做cDNA第一链反应，再接着做PCR，用特异引物扩增一直是弥散，改用Poly T后又扩不到我要的目的条带，甚是着急，请高手指点了，谢谢：）
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1楼 2008-07-10 22:15:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
1、引物浓度降低点
2、设计的引物要排除基因组DNA的干扰，因此是跨内含子设计。
3、是不是胶的浓度太低了？跑出来的条带就容易散掉。缓冲液不新鲜也会这样子的，配出来的胶和电泳液就不大ok~
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2楼2008-07-11 00:32:19
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mikezhuang

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
条带弥散，1，引物的特异性不强
              2，提高退火温度
RNA的质量如何：它是根本。
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3楼2008-07-11 09:26:49
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chuyinghao

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
1 检查一下你的试剂盒的问题，是什么牌子的，牌子不好效果可能不好，是否过期！
2 RNA电泳是否为三条带!比例如何？是否28S为18S的2倍！RNA是否降解？？
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4楼2008-07-11 09:43:18
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
我的RNA提取还是效果不错的，不过先按照大家的建议改进一下吧，谢谢了
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5楼2008-07-11 14:41:02
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
我用QIAGEN来提取总RNA，用invitrogen的SuperScript 111 First-Strand System for RT-PCR做CDNA第一链反应，后面就是普通PCR反应，不知道会有啥问题
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6楼2008-07-11 14:55:53
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