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组织细胞的培养
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(一)原代细胞培养操作要领 1,原代细胞混匀操作要领 ①火焰消毒吸管,用Hanks液冷却和湿润管内壁(这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上). ②吸管头插入管底. ③用吸管反复轻轻吹打组织块. 2,器械的使用操作要领 ①用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械. ②器械置无菌干纱布内擦一下,迅速通过火焰,冷却后使用. ③用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒. ④器械按浸泡消毒的顺序使用. ⑤各套再消毒器械不可混用. 3,除去组织块多余水分的操作要领 用吸管将组织块推向器皿一角,然后将有组织块的瓶面翻向上方,吸去流向对侧的多余水分. 注意:多余水分若不除去,会使组织块剪切不细.消化后的细胞悬液清亮(细胞数少),并可见消化液中有线状或絮状物漂浮. 4,细胞计数操作要领 ①用吸管混匀待计数的细胞悬液. ②将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入细胞计数池中. ③沉降1分钟,低倍镜下计数血球计数板四大中格中的结构完整的细胞,小细胞团计数为l. ④计数时,如果细胞压在格上,则数上不数下,数左不数右.然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数. (四大中格细胞数/4)×10000=细胞数/毫升 注:细胞计数板上,每-中格体积为0.1立方毫米. (二)原代细胞培养注意事项 1,严格进行动物皮肤消毒,使用三套器械取材.新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒,成年鼠先用3%～5%碘酒液消毒,后再用75%酒精消毒. 2,严格进行无菌操作,防止细菌,霉菌,支原体污染,避免化学物质污染. 3, 吸取液体前,瓶口和吸管口应行火焰消毒;吸取液体时,避免两者碰撞. 4,离心管入台前,管口,管壁应消毒. 5,实验者离开超净台时,要随即用肘部关闭工作窗. 6,使用过的器械用酒精棉球擦去血污后,移入另一个器皿中继续消毒,在浸泡器械时剪刀口要叉开放,镊子弯头要向下放,并加盖消毒. 7,器材使用时既要注意用火焰消毒,又要防止烫伤,烫死细胞.经火焰消毒后的吸管一定要用PBS液冷却.超净台内温度,湿度较大,在夏天工作时台内散热更慢.因此进行细胞悬液混匀,接种时,离火焰要稍远些. 一,鸡胚成纤维细胞培养 通常应用胚胎或幼小动物的组织来制备细胞培养,因为它们分裂旺盛,容易生长.各种动物的大多数组织细胞都能在体外培养.应用最多的为肾,肺,皮肤等,鸡胚组织应用最为普遍. (一)鸡胚的处理 取10～11日龄的鸡胚,在气室部用5%碘酒消毒,用酒精脱碘. 用灭菌镊子击破和除去该部卵壳和卵膜. 以眼科弯头镊子撕破绒尿膜和羊膜,钩住鸡胚头部,提出移于平皿内. 去头,脚,翅和内脏.用Hanks液或PBS液洗去血液,重复三次. 用外科剪剪成1～2mm3大小的碎块.加Hanks液约20m1混匀,稍静置使组织块下沉.用灭菌吸管将混有红细胞及碎片的悬液充分吸去.依同法再洗2—3次,至Hanks液不浑浊为止.也可将鸡胚投入20m1注射器(不带针头)内挤出,以替代剪碎. (二)蛋白酶消化 将0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.8) 于37℃水浴中预热 弃去Hanks液. 按组织块的3～5倍,将预热好的0.25%胰蛋白酶溶液加于装有鸡胚的玻璃容器中.每个鸡胚约需胰蛋白酶液l0ml. 将玻璃容器放在37℃水浴中,每隔5min轻轻摇匀一次.如发现组织块变得散松,沉降渐变缓慢时即表示消化足够,约需l 5～20min. 将玻璃容器取出水浴,静置1～2min,吸去胰蛋白酶液,加含犊牛血清的Hanks液约20m1,轻轻摇匀后吸去,如此重复一次,目的是洗去残余的胰蛋白酶和抑制其消化作用. 加入生长液,按每个鸡胚10m1左右,以粗口吸管吹吸数次,使细胞脱落分散. 静置1～2min,使组织块下沉,细心地轻轻吸出细胞悬液,另置一25m1玻璃容器中.如此反复数次,将各次收获的细胞悬液合并一起. 用灭菌纱布过滤一次,除去偶尔吸入的组织块.必须注意的是,每次吹吸次数不宜过多,一般5～6次即可,太多细胞容易受损. (三)细胞计数 可借染色法区别活细胞和死细胞,并计算每毫升细胞个数. 1.配制台盼蓝溶液 取0.2g台盼蓝,溶于100m1磷酸平衡盐水中贮存,临用前再稀释10倍.这是一种活体染液,完整的活细胞不被染色,而细胞膜受损后才染成蓝色. 也可用0.01%结晶紫液(用0.lmo1/L柠檬酸配制)染色,这时细胞核被染成蓝紫色,但只能计数而无法区分死活.) 2.取摇匀的细胞悬液1滴加于玻片上,加染液4滴,混匀后静置4～5min. 3.吸取细胞悬液少许,滴到血细胞计数板上,计算四角4个大格内完整的细胞数,如几个细胞聚集一起,则按一个细胞计算.然后将活细胞总数换算成每m1中细胞数,最后还要乘以5,因为细胞已被染液稀释5倍. 活细胞数/ml=(4大格活细胞总数/4)×l0 000× 5 (四)稀释和分装 根据细胞计数的结果,以生长液配成每m1含20～40万细胞的悬液,分装细胞培养瓶.微量细胞培养板每孔(0.3cm2)0.1m1;转瓶培养每100ml容量加10m1细胞悬液.必须注意,瓶口务必塞紧,不能漏气,否则在培养过程中C02不断逸出而使营养液迅速变碱,而且容易被细菌污染. (五)生长液和维持液的配方 鸡胚细胞较易生长,常用者有下列两种. 1.0.5%乳蛋白水解物 95% 犊牛血清 5% 青霉素 100IU/m1 链霉素 100Ug/m1 此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至1—2%即可. 2.Eagle氏MEM 95% 犊牛血清 5% 青霉素 100IU/m1 链霉素 100Ug/m1 此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至1～2%即可. 细胞悬液分装后置37℃温箱内静置培养,几小时后细胞即可贴附于瓶壁,24～48h长成单层,此时即可供接种病毒之用.如发现液体浑浊(有细菌或酵母生长)或有菌丝体 (有霉菌生长),应立即弃去. 如为微量细胞培养,可用涤纶胶布将板面密封,置C02培养箱内培养.如为转瓶培养,可将培养瓶放置在转鼓上,以6～12r/h的速度在37℃培养. 二,兔肾上皮细胞培养 (一)实验材料: 兔婴(出生48小时内尚未进食兔婴,体重300～500g). 2.培养基与试剂:含10%FBS(或CS)的MEM,CMF-Hanks液,0.25胰酶/CMF-PBS. 3.器具:各种吸管,离心管,80～100目尼龙网或不锈钢筛网,三角烧瓶,培养皿,瓶,手术刀,剪,镊,1%新洁尔灭消毒缸,解剖板等. (二)实验方法 1.取肾:取2日龄内兔婴,将其断颈处死后,放入1%新洁尔灭溶液中浸泡lOmin.取出兔婴,放置瓷盘内的木板上,背部向上,四脚钉住固定.用碘酒,酒精消毒背部皮肤,用剪刀和镊子将背部皮肤剪开剥去.另换剪刀,在腰部背脊长肌两侧剪开腹腔如蚕豆大的缺口,即可看到肾.用尖头镊子夹紧肾蒂,剪断血管及结缔组织等,将肾提出放在平皿内. 2.组织处理及消化:剪下肾皮质部分,移入小三角烧瓶内,用小剪细剪成1mm3左右的组织块,用PBS或Hanks液洗3次,吸弃上清液,视其沉下的组织块量,约加10倍量的0.25%胰酶, 于37℃水浴中消化30min.以下步骤及方法与鸡胚细胞制备相同,不赘述. 3.胰蛋白酶消化 分热消化和冷消化两种.热消化与鸡胚成纤维细胞相同,但时间必须延长到25～30min.如欲获得更多的细胞,可在消化瓶内预放几十粒玻珠,消化后转动消化瓶使细胞脱落.在吸出的胰酶～细胞悬液中加入犊牛血清2m1以终止酶的作用. 剩下的组织块另加胰蛋白酶液继续消化20min,重复上述步骤1～2次,即可将组织几乎消化殆尽. 许多实验室喜用冷消化,即在组织块内加入7一10倍量的胰蛋白酶液,在4℃冰箱内消化过夜,翌日晨取出,按热消化法处理. 4,细胞计数 同鸡胚成纤维细胞. 5,生长液和维持液的配方 1).0.5%乳蛋白水解物 45% Eagle氏MEM 45% 犊牛血清 10% 青霉素 100 IU/m1 链霉素 100 Ug/m1 此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至3—5%. 2).Eagle氏MEM 90% 犊牛血清 10% 青霉素 100 IU/m1 镕霉素 100 Ug/m1 此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至3～5%. 6,细胞悬液的稀释和分装 与鸡胚成纤维细胞同,细胞浓度为50万/m1.在37℃培养4～5日可以长成单层. 三,鸡胚心肌块的培养 实验用品 1.孵育9～11日龄鸡胚一个 2.培养液:MEM+20%小牛血清(CS),CS,无钙镁Hanks液(CMF-Hanks)或pH=7.2的PBS. 3.器具:各种吸管,弯头吸管,60mm培养平皿或25cm2 培养瓶,90mm玻璃平皿一个,60mm玻璃平皿3个,镊子,眼科剪,吸管架,鸡卵架等. 实验方法 1.鸡胚摘出: 取9～11日龄鸡胚于卵架上,用碘酒,酒精消毒鸡胚气室侧,用镊子敲开气室部,剪开气室部蛋壳,用镊子摘除卵壳膜,轻轻夹住鸡胚颈部取出鸡胚于无菌90mm平皿内,注意不要强拉鸡胚颈部. 2.制备心肌块: 用镊子固定鸡胚,从腹部向胸部切开,用镊子摘除心脏,移入装有10mlCMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的60ml的平皿内,用刀将心房和血管等切除,心室放CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿中充分洗涤,然后将心室移入另一装有CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿内,用刀将心室切成适当大小(1～2mm3)小块, 于CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS液中洗涤数次,转入装有少量生长液的平皿中暂存. 3.培养与观察: 将组织小块转移到培养瓶内,每只体积为25ml的培养瓶内可放置20～30块组织轻轻地倾斜摆动培养瓶,使组织小块均匀地分布于生长细胞瓶内壁表面上.把瓶盖盖上,放入恒温培养箱内,静置18-24小时,添加少量培养液. 待外植块均巳粘附玻壁上后,约经过2天后,在每只培养瓶内添加足量培养液.培养至3～5天后, 于相差显微镜下观察心肌细胞的形态及节律性收缩现象. 实验五 传代细胞的培养 实验材料 1.蛋白酶消化液:主要是用无Ca2+,Mg2+的平衡盐溶液或者PBS配制的0.08%～0.25%(m/V,下同)胰蛋白酶溶液,其中也可以再补加0.02%的EDTA(或1 mmol/L).有时候还需要0.02%～0.03%或200IU/ml的胶原酶溶液甚或其它的消化液. 2.培养器皿:一般与进行原代培养时所用类型相同.所需数量须根据拟传代的规模而定. 3.培养液及平衡盐溶液:同原代培养. 实验方法 (一)贴壁细胞传代培养方法 1.取需要传代的细胞培养瓶,轻轻摇动培养瓶数次,悬浮起浮着在细胞表面的碎片,然后连同生长液一起倒出,用无钙镁的磷酸平衡盐溶液洗涤2次. 2.从无细胞面加入0.25%0.1%胰蛋白酶液或0.02%EDTA液(或两者等量混合)4～5ml,将该培养瓶翻转,使消化液浸没细胞层. 3.在37℃放置8～15min.中途取出,用肉眼或低倍显微镜观察.如单层边缘略有卷边,或低倍下细胞间已有缝隙,细胞层出现布纹孔,即表明消化适度.(如果细胞突起缩回,细胞之间间隙增大,细胞近乎缩成圆形,应立即终止消化.) 4.将培养瓶倒置,使细胞不再接触酶液,继续在37℃放置几分钟. 5.取出,倾去酶液越彻底越好,加入生长液后用吸管吸吹数次,使细胞分散. 6.装入离心管,离心(1000r/min,5min).除去上清含酶溶液. 7.用培养液将细胞沉淀重新悬浮.计数并调整细胞密度. 8.每瓶细胞单层可扩大分装2～4瓶. 9.37℃静置培养1～2天又可长成单层 (二)悬浮细胞传代培养方法 悬浮培养的细胞可直接将培养物吸取一部分或者将培养物离心后再分成几部分并接种培养即可. 1,将培养物转移到离心管内,离心(1000r/min,5min). 2,吸出上清液.给细胞沉淀加入培养液重新悬浮. 3,分别取部分细胞悬液,接种在数个培养皿内. 4,补加培养液.入培养箱继续培养. 若为直接分部传代,仅需停止搅拌或摇动,待细胞自然下沉.吸去大部分上清培养液,再用吸管吹匀培养物成细胞悬液.分别吸取部分细胞悬液接种在数个培养器皿内.补加培养液.入培养箱内进行培养. 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