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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎样用pET21b给目的基因加上histag再转入另一个质粒中
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xxyysong

新虫 (初入文坛)

[求助] 怎样用pET21b给目的基因加上histag再转入另一个质粒中

各位师兄师姐，我的实验是接着之前的师兄的做。我们想用histag标记一个李斯特菌的目的基因然后再放回到李斯特菌里进行表达。之前的师兄留下的材料不是很清楚。大概意思是把目的基因从李斯特菌中酶切出来，然后把histag基因也酶切出来在连在一起转入pDG148，一个可以在李斯特菌中表达的质粒。但是我发现的问题是pET21b上的histag的酶切位点和pDG148不符合。我想的办法是把目的基因先转到pET21b上带上histag后把整个片段再切下来转入pDG148。但是pET21b上histag之前的位点只有一个叫blpI(80)的，在pDG148上没有这个酶切位点。

另一种办法我想是在引物里设计带histag，但是我怎样再把它和pDG148连上呢。求助各位大神，我实在是没查到特别相关的资料。谢谢！

附上pET21b和pDG148的图谱。怎样用pET21b给目的基因加上histag再转入另一个质粒中
pDG148 map.jpg
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  • 附件 1 : pET-21b(+)_Sequence_and_Map.pdf
    • 2015-03-29 06:47:22, 311 K

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1楼 2015-03-29 06:49:04
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xxyysong(西门吹雪170代发): 金币+8, 鼓励热心回帖交流 2015-03-30 20:58:14
1. 设计引物用Pfu酶把HIS标签从pET21b质粒中扩增，具体就是 Forward 端方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如HidIII）+HIS，Rverse  端方向 引物就是5-his目的片段  
2  设计引物用pfu酶把目的基因扩增，引物要求是F 端引物是5-目的基因引物，Rverse方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如Sal 酶）+目的基因引物 （用pfu酶扩增的话最好用质粒做模板，一般用DNA的话扩增不出来）
3.分别将上述扩增产物胶回收或者纯化，混合或者用T4连接酶连接，再用 Forward 端方向引物 5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如saI酶）+HIS引物，Rverse方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点+目的基因引物 这时你可以用加A尾的taq酶扩增，LAtaq或者其他的，把它克隆PMD-19simple 载体中去（这个载体没有酶切位点，引物上带的就是酶切位点）
4.做双酶切连接。
请注意，如果你的片段或者标签序列都有pDG148上这几个酶切位点，那么这个实验就不能用以上这种方法做。

第二种方法，
买个重组酶把。前面3个步骤照样做好。做到pmd-19simple里面去后，按照重组酶的引物设计要求再去设计一对引物做。你得注意his标签+目的基因连到pDG148里面的移码问题。

如果你师兄做好的载体里面tag+目的基因放到Pdg148里面不移码的话，可以用重组酶按照要求直接可以重组到pDG148里面去。
我的方法大概就是这样子。
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。
2楼2015-03-29 10:11:50
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xxyysong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-03-29 10:11:50
1. 设计引物用Pfu酶把HIS标签从pET21b质粒中扩增，具体就是 Forward 端方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如HidIII）+HIS，Rverse  端方向 引物就是5-his目的片段  
2  设计引物用pfu酶把目的基因扩增，引 ...

谢谢回复， 还有一个问题就是我的目的基因片段需要敲除终止密码子吗。还是直切用T4连接酶就可以把目的基因和his连上？谢谢！
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3楼2015-03-30 05:46:57
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xxyysong at 2015-03-30 05:46:57
谢谢回复， 还有一个问题就是我的目的基因片段需要敲除终止密码子吗。还是直切用T4连接酶就可以把目的基因和his连上？谢谢！...

你是把标签放到目的基因后面是吧？目的基因的 Reverse 引物上不加上终止密码子就把终止密码子敲出了啊。
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4楼2015-03-30 09:46:23
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xxyysong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-03-30 09:46:23
你是把标签放到目的基因后面是吧？目的基因的 Reverse 引物上不加上终止密码子就把终止密码子敲出了啊。...

谢谢。我查文献查到有一个质粒和pDG148有同样的酶切位点。如果我要把这个质粒的his-tag带到目的基因的后面的话我是不是要敲除终止密码子？
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5楼2015-03-30 11:45:27
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shenqiyao

新虫 (初入文坛)
请问你有pDG148的序列吗，能发给我一份吗，急求。。。谢谢啊
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6楼2016-01-15 17:19:09
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