| 查看: 4694 | 回复: 5 | |||
[求助]
怎样用pET21b给目的基因加上histag再转入另一个质粒中
|
|
各位师兄师姐，我的实验是接着之前的师兄的做。我们想用histag标记一个李斯特菌的目的基因然后再放回到李斯特菌里进行表达。之前的师兄留下的材料不是很清楚。大概意思是把目的基因从李斯特菌中酶切出来，然后把histag基因也酶切出来在连在一起转入pDG148，一个可以在李斯特菌中表达的质粒。但是我发现的问题是pET21b上的histag的酶切位点和pDG148不符合。我想的办法是把目的基因先转到pET21b上带上histag后把整个片段再切下来转入pDG148。但是pET21b上histag之前的位点只有一个叫blpI(80)的，在pDG148上没有这个酶切位点。 另一种办法我想是在引物里设计带histag，但是我怎样再把它和pDG148连上呢。求助各位大神，我实在是没查到特别相关的资料。谢谢！ 附上pET21b和pDG148的图谱。  pDG148 map.jpg |
回复此楼» 本帖附件资源列表
-
欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : pET-21b(+)_Sequence_and_Map.pdf
2015-03-29 06:47:22, 311 K
» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有80人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有7人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
我欲乘风归去
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 3280.1
- 散金: 1055
- 红花: 26
- 帖子: 841
- 在线: 878.8小时
- 虫号: 3340869
- 注册: 2014-07-27
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xxyysong(西门吹雪170代发): 金币+8, 鼓励热心回帖交流 2015-03-30 20:58:14
xxyysong(西门吹雪170代发): 金币+8, 鼓励热心回帖交流 2015-03-30 20:58:14
|
1. 设计引物用Pfu酶把HIS标签从pET21b质粒中扩增，具体就是 Forward 端方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如HidIII）+HIS，Rverse 端方向 引物就是5-his目的片段 2 设计引物用pfu酶把目的基因扩增，引物要求是F 端引物是5-目的基因引物，Rverse方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如Sal 酶）+目的基因引物 （用pfu酶扩增的话最好用质粒做模板，一般用DNA的话扩增不出来） 3.分别将上述扩增产物胶回收或者纯化，混合或者用T4连接酶连接，再用 Forward 端方向引物 5-保护碱基+pDG148上的酶切位点（如saI酶）+HIS引物，Rverse方向引物是5-保护碱基+pDG148上的酶切位点+目的基因引物 这时你可以用加A尾的taq酶扩增，LAtaq或者其他的，把它克隆PMD-19simple 载体中去（这个载体没有酶切位点，引物上带的就是酶切位点） 4.做双酶切连接。 请注意，如果你的片段或者标签序列都有pDG148上这几个酶切位点，那么这个实验就不能用以上这种方法做。 第二种方法， 买个重组酶把。前面3个步骤照样做好。做到pmd-19simple里面去后，按照重组酶的引物设计要求再去设计一对引物做。你得注意his标签+目的基因连到pDG148里面的移码问题。 如果你师兄做好的载体里面tag+目的基因放到Pdg148里面不移码的话，可以用重组酶按照要求直接可以重组到pDG148里面去。 我的方法大概就是这样子。 |
2楼2015-03-29 10:11:50
3楼2015-03-30 05:46:57
我欲乘风归去
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 3280.1
- 散金: 1055
- 红花: 26
- 帖子: 841
- 在线: 878.8小时
- 虫号: 3340869
- 注册: 2014-07-27
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
4楼2015-03-30 09:46:23
5楼2015-03-30 11:45:27
6楼2016-01-15 17:19:09
