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求助连接转化
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最近在做表达，一直不成功。 我用的载体是pET30a，酶切位点是Nco11 和 Sal1，载体酶切是两个单酶切，中间做乙醇沉淀，先用Sal1切的，50的体系加0.5的酶，2h，时间一长就会切碎，用Nco1切，之前的两个50体系和为一个50体系，加0.5的酶，时间长过1h就会有很多切碎，跑胶条带除了一条或两条相对清晰的带，还有大片的弥散，切胶回收效果也不是很好。但我还是努力收集载体达到一定浓度，大概20ng/ml。PCR产物（900bp）双酶切，终浓度也在10到20ng之间，1：1比例4度连接过夜，转出来的都是蓝斑。我想可能是部分没有酶切完全的自连了（酶切时间再长就碎了，不知道该怎么控制）但是也有好多是完全的，为什么都连不上呢？ 我该怎么做？请各位大虾指教，谢谢了 |
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