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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒构建
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?R逍遥游

铁虫 (初入文坛)

[求助] 质粒构建 已有1人参与

求助，我要构建个表达质粒，从PBMC里提取RNA，逆转录得到的CDNA，然后以CDNA为模板PCR，切胶回收，酶切连接，构建好质粒，转化到DH5a中，涂板，菌落PCR，后挑取的阳性克隆，摇菌，提取质粒，送去2个侧序后，发现2个质粒分别单点突变，点突变的位置都不一样。然后加测了反向之后，发现还是和前面结果一样。求高手指点。该怎么办，是怎么回事？
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1楼 2015-03-23 14:36:48
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?R逍遥游

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-03-23 15:07:31
其实你不需要加测反向的，应该增加送样量，送4个或者5个都行，再挑一个正确的往下做

可是为什么会出现这种情况呢？在增加送样量，会有正确的吗？我后来又送了一个，还是这种情况。有新的点突变，不是同一个位置。
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3楼2015-03-23 15:53:38
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-24 09:19:11
其实你不需要加测反向的，应该增加送样量，送4个或者5个都行，再挑一个正确的往下做
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没有做不到，只有想不到！
2楼2015-03-23 15:07:31
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艰苦温度

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ?R逍遥游 at 2015-03-23 15:53:38
可是为什么会出现这种情况呢？在增加送样量，会有正确的吗？我后来又送了一个，还是这种情况。有新的点突变，不是同一个位置。...

最直接就是把突变的点突变回来
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4楼2015-03-23 16:51:46
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-24 09:19:16
?R逍遥游: 金币+6, ★★★很有帮助, 谢谢了 2015-03-24 09:22:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by ?R逍遥游 at 2015-03-23 15:53:38
可是为什么会出现这种情况呢？在增加送样量，会有正确的吗？我后来又送了一个，还是这种情况。有新的点突变，不是同一个位置。...

这些点突变是由于PCR错配造成的，增加送样量，会有正确的，我之前也做过原核表达，一次送了6各样测序，才有2个是完全正确的
赞一下(1人) 回复此楼
没有做不到，只有想不到！
5楼2015-03-23 22:19:20
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